Questo metodo è uno strumento prezioso nel campo della biologia cellulare per valutare i livelli di ROS cellulari in cellule primarie viventi coltivate in vitro come organoidi utilizzando una sonda fluorogenica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ROS possono essere visualizzati qualitativamente in organoidi intestinali intatti al microscopio e analizzati quantitativamente in cellule dissociate mediante citometria a flusso utilizzando piastre a 96 pozzetti. Questo metodo può essere applicato ad altri modelli di organoidi e sensori fluorescenti alternativi potrebbero essere utilizzati per analizzare diversi percorsi cellulari.
Prima di applicare questo protocollo per la prima volta, lo sperimentatore dovrebbe familiarizzare con la coltura organoide e il passaging. Sebbene il nostro protocollo sia ben adattato agli approcci di screening, i principianti dovrebbero iniziare con alcuni campioni. A dimostrare la procedura sarà Sophie Dulauroy, un ingegnere del laboratorio.
Dopo aver sacrificato un topo Lgr5-GFP di 8-10 settimane, raccogliere da cinque a otto centimetri del digiuno che comprende la regione compresa tra il duodeno e l'ileo e metterlo in DPBS freddo integrato con antibiotici sul ghiaccio. Quindi, pulire il contenuto intestinale lavando con cinque a 10 millilitri di DPBS freddo contenente antibiotici. Quindi usando le forbici a punta di palla, apri l'intestino longitudinalmente e usando una pinza, trasferisci il tessuto in una capsula di Petri contenente DPBS freddo con antibiotici.
Agitare il fazzoletto all'interno del piatto per risciacquarlo. Quindi, afferrare l'intestino per aspirazione utilizzando una pipetta Pasteur di plastica e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di EDTA freddo da 10 millimolari. Capovolgere il tubo tre volte e incubarlo sul ghiaccio per 10 minuti.
Dopo l'incubazione, trasferire il tessuto in un tubo contenente 10 millilitri di DPBS e vortice per due minuti. Aggiungere immediatamente 10 microlitri della frazione in una capsula di Petri e utilizzare un microscopio per valutare la qualità della frazione. Dopo due trasferimenti in tubi contenenti DPBS con vortice di due minuti tra ogni trasferimento, incubare l'intestino in EDTA su ghiaccio per cinque minuti, come dimostrato in precedenza.
Dopo tre trasferimenti successivi in tubi contenenti DPBS con vortice di tre minuti tra ogni trasferimento, combinare le migliori frazioni in un tubo da 50 millilitri invertendo i tubi selezionati tre volte e filtrando attraverso un filtro cellulare da 70 micron. Quindi ruotare le cripte, scartare il surnatante e interrompere meccanicamente il pellet prima di aggiungere cinque millilitri di DMEM F12 freddo. Contare manualmente al microscopio il numero di cripte presenti in un'aliquota di 10 microliti.
Dopo aver contato, ruotare di nuovo le cripte e rimuovere con cura il surnatante. Quindi interrompere meccanicamente il pellet e aggiungere il terreno di coltura di crescita al tubo per ottenere una concentrazione di 90 cripte per microlitro. Quindi, aggiungere due volumi di matrice di membrana basale non diluita o BMM per ottenere una concentrazione finale di 30 cripte per microlitro e pipettare con cura la sospensione su e giù senza introdurre bolle d'aria nella miscela.
Per l'analisi della citometria a flusso, la piastra 10 microlitri delle cripte BMM si mescola come una cupola al centro di ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti rotondi preriscaldata. E per l'imaging, depositare 10 microlitri della miscela come strato sottile in una camera a otto pozzetti microslide preriscaldata. Dopo aver lasciato che il BMM si solidificasse a temperatura ambiente per cinque minuti, posizionare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Dopo 15 minuti, aggiungere 250 microlitri di terreno di coltura in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non staccare il BMM e posizionare la piastra nell'incubatrice. Per visualizzare lo stress ossidativo mediante microscopia confocale, aggiungere un microlitro di soluzione madre di n-acetilcisteina nei corrispondenti pozzetti della camera a otto pozzetti microslide placcata con organoidi. Dopo un'incubazione di un'ora, aggiungere un microlitro di soluzione madre di idroperossido di terz-butile nei pozzetti corrispondenti e incubare per altri 30 minuti.
Quindi, aggiungere un microlitro della diluizione 1,25 millimolare della sonda fluorogenica per pozzetto, seguito da un microlitro di 1,25 milligrammi per millilitro soluzione di Hoechst. Dopo un'altra incubazione di 30 minuti, rimuovere il mezzo senza disturbare il BMM e aggiungere delicatamente 250 microlitri di DMEM caldo senza rosso fenolo. Immagina gli organoidi usando un microscopio confocale dotato di una camera termica e di un'alimentazione di gas che rileva la sonda fluorogenica.
Utilizzando il controllo positivo, impostare l'intensità del laser e l'esposizione temporale per il segnale ROS e verificare che questo segnale sia inferiore nel controllo negativo. Successivamente, utilizzando un oculare, schermare la diapositiva per identificare gli organoidi che esprimono GFP e regolare l'intensità del laser. Impostare una z-stack di 25 micrometri e definire le posizioni per ottenere un'immagine cucita dell'intero organoide per ottenere una sezione degli organoidi che mostra uno strato di cellule.
Aggiungere un microlitro della soluzione madre di n-acetilcisteina nei pozzetti di controllo negativi della piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti contenente gli organoidi. Dopo un'incubazione di un'ora, aggiungere una soluzione madre di idroperossido di terz-butile microlitro nei pozzetti corrispondenti e incubare per 30 minuti. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere il mezzo senza disturbare il BMM collegato e trasferirlo su un'altra piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti.
Tieni da parte questo piatto. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tripsina e utilizzando una pipetta multicanale, pipetta su e giù cinque volte per distruggere il BMM. Dopo una breve incubazione di cinque minuti, dissociare gli organoidi pipettando su e giù una seconda volta.
Ruotare il piatto e scartare il surnatante invertendo il piatto. Aggiungere il mezzo precedentemente raccolto in un'altra piastra a 96 pozzetti nei pozzetti corrispondenti e risospesciare le cellule tubando su e giù cinque volte. Quindi, aggiungere un microlitro della sonda fluorogenica e incubare per 30 minuti.
Quindi ruotare nuovamente la piastra e risospescere le celle con 250 microlitri di soluzione DAPI. Trasferire i campioni in provette citometriche a flusso e mantenere i tubi sul ghiaccio. Ottimizza le impostazioni della tensione di dispersione anteriore e laterale sul controllo non macchiato e sulle tensioni laser per ciascun fluoroforo utilizzando campioni monocolorati.
Quindi, utilizzando una strategia di gating appropriata, raccogliere un minimo di 20.000 eventi. Immagini confocali rappresentative di colorazione ROS e organoidi hanno mostrato che in presenza dell'inibitore NAC, è visibile solo il segnale proveniente dalle cellule morte contenute nel lume dell'organoide. Nell'organoide non trattato, i livelli basali di ROS possono essere visti, in particolare nelle cellule GFP positive, dimostrando che le cellule staminali producono ROS più alti rispetto alle cellule differenziate.
Le cellule GFP positive presentano un segnale citoplasmatico più significativo con l'induttore in presenza della sonda fluorogenica, dimostrando che i livelli di ROS aumentano in particolare nelle cellule staminali dopo il trattamento. L'analisi citometrica a flusso della produzione di ROS negli organoidi intestinali mostra che i livelli basali di ROS diminuiscono dopo la stimolazione con inibitore e aumentano dopo la sfida con l'induttore. Le cellule pretrattate con inibitore e poi stimolate con induttore presentano livelli inferiori rispetto a quelle stimolate con il solo induttore.
Un'analisi simile sulle cellule staminali gated come GFP positive mostra una diminuzione di 3,5 volte del livello di ROS dopo il trattamento con inibitori e un aumento di quattro volte dopo il trattamento con induttore rispetto alle cellule non stimolate. Quando si tenta questa procedura, gli utenti dovrebbero ricordare di limitare lo stress cellulare durante la manipolazione organoide e la dissociazione. Inoltre, i controlli positivi e negativi dovrebbero sempre essere inclusi durante l'analisi dei ROS.
Seguendo questa procedura, l'analisi può essere integrata dalla colorazione a immunofluorescenza su organoidi intatti fissi, dallo smistamento cellulare e dall'analisi dell'espressione genica per ottenere ulteriori informazioni sulla regolazione dei ROS. Dopo aver guardato questo video, dovresti sapere come coltivare organoidi intestinali murini, eseguire analisi di imaging dal vivo di organoidi intatti ed elaborare organi intestinali per l'analisi della citometria a flusso.
