L'attuale tecnologia consente l'uso di anticorpi allevati nella stessa specie per rilevare fino a sette marcatori. A dimostrare la procedura sarà Loucia Chan, un tecnico del laboratorio. Iniziare preparando i vetrini di vetro incorporati in paraffina fissata alla formalina montati con il campione di tessuto, posizionando i vetrini piatti in un forno, per cuocere a 60 gradi Celsius con il tessuto rivolto verso l'alto.
Dopo un'ora, scerare e reidratare i vetrini per 10 minuti ciascuno con la serie di sostanze chimiche, come descritto nel manoscritto. Immergere i vetrini in soluzione salina tris-buffered, e poi in una scatola di plastica riempita con una miscela di formaldeide diluita in metanolo, per fissare i campioni. Quindi, lavare le diapositive due volte in acqua deionizzata per due minuti.
Procedere al recupero dell'epitopo, posizionando il rack di vetrini in una scatola di resistenza al calore riempita con tampone di acido citrico a pH 6,0. E poi posizionando la scatola nel microonde, per riscaldare prima i vetrini al 100% di potenza per 50 secondi, seguiti da 20 minuti al 20% di potenza, per mantenere la stessa temperatura. Dopo aver risciacquato i vetrini in acqua distillata e lavato con TBST, immergere il vetrino in un barattolo contenente una soluzione che blocca la perossidazione per 10 minuti.
Dopo l'incubazione, sciacquare i vetrini in acqua distillata e lavare con TBST, quindi utilizzare una penna barriera idrofoba per segnare un confine attorno alla sezione del tessuto sul vetrino. Quindi risciacquare il vetrino in TBST, coprire le sezioni di tessuto con il tampone bloccante e incubare i vetrini in una camera umidificata per 15 minuti. Per rimuovere i reagenti bloccanti, prima incubare i vetrini con l'anticorpo primario di interesse, quindi rimuovere l'anticorpo primario lavando i vetrini tre volte con TBST, prima dell'incubazione con il polimero perossidasi di rafano etichettato, anticorpo secondario.
Dopo l'incubazione, lavare i vetrini prima di applicare la flora opalina per la soluzione di lavoro TSA, quindi risciacquare il vetrino con il tampone di recupero dell'antigene. Eseguire lo stripping a base di microonde riscaldando i vetrini nel tampone di recupero dell'antigene in un forno a microonde con una potenza del 100%, per 50 secondi, seguita da una potenza del 20% per 20 minuti nei contenitori sicuri per microonde. Dopo aver raffreddato i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti, sciacquare i vetrini in acqua distillata e TBST e successivamente incubare con soluzione dappy per cinque minuti.
Quindi asciugare all'aria la slitta prima del montaggio con il mezzo di montaggio appropriato. Prima dell'imaging delle diapositive preimpostare gli appositi filtri nella postazione di lavoro. Cattura un minimo di 10 campi per l'analisi con un ingrandimento inferiore a 200 volte.
Per contare le celle, fare clic sul pulsante Conta oggetti nella barra dei passaggi, per visualizzare il pannello delle impostazioni di conteggio degli oggetti. Se il tessuto è stato segmentato, selezionare la categoria di tessuto in cui si trovano gli oggetti. Quindi selezionare il ridimensionamento del segnale desiderato dalla scala automatica o dalla scala fissa.
Per la segmentazione degli oggetti, selezionare il componente principale dall'elenco a discesa. Per rilevare oggetti che toccano altri oggetti come oggetti singoli e non combinati, selezionare la casella dimensioni massime e pixel e quindi optare per la divisione raffinata. Quindi, contare tutte le cellule stromali nelle cellule immunitarie separatamente, per esprimere i dati come percentuali delle cellule immunitarie rispetto al numero totale di cellule stromali per ogni immagine catturata.
Successivamente, riportare il conteggio finale delle celle come media di tutti i campi. Utilizzando l'editor di viste, esaminare le tabelle di dati risultanti dopo l'elaborazione e quindi esportare la tabella dei dati di conteggio. Nell'analisi rappresentativa, quattro tipi di cellule immunitarie nel campione di endometrio siamo differenziati.
L'immagine elaborata mostra la segmentazione dei tessuti come compartimenti epiteliali e stromali. L'immunocolorazione multiplex è stata eseguita sulle biopsie endometriali da una donna di controllo fertile e una donna con aborto spontaneo ricorrente inspiegabile, piano singolo per noi che rappresenta CD3, CD56, CD68 e CD20 sono stati rivelati nell'immunocolorazione. Una volta identificato il suono immunitario, un'ulteriore colorazione sotto la citochina può aiutare ad affrontare la loro interazione e il meccanismo per il successo dell'impianto.
