Questo protocollo presenta un metodo per vivere l'immagine, far volare l'assemblaggio del circuito olfattivo a livello di singolo assone da un cervello in via di sviluppo. dissezione per pulire il tessuto che copre il cervello in via di sviluppo, possiamo raccogliere immagini di alta qualità dal cervello interno. Questo metodo fornisce preziose informazioni sulle basi biologiche cellulari dello sviluppo del circuito.
Può essere facilmente modificato per studiare anche lo sviluppo di altri circuiti. Ci vuole un po 'di tempo perché una persona esegua un controllo manuale stabile nella microdissezione. Più pratica sarà utile.
Per iniziare, preparare il piatto di coltura per mobilitare l'espianto durante l'imaging time-lapse posando Sylgard di 0,5 centimetri di spessore sulla superficie inferiore di una capsula di Petri e lasciandolo polimerizzare per 48 ore a temperatura ambiente. Per preparare micro pin per immobilizzare l'espianto su questa piastra usando una pinza, attaccare più micro pin su un nastro con le estremità affilate allineate su un lato e tagliare due millimetri di estremità affilate con le forbici. Quindi, utilizzando la pinza, inserire i micro perni tagliati nello strato Sylgard di una piastra Sylgard prefabbricata.
Usando un pennello, raccogli le pupe bianche, che formano il pupario entro un'ora e trasferiscile in una nuova fiala. Incubare le pupe a bagnomaria temperate a 37 gradi Celsius per 40 minuti per indurre cloni ORN sparsi da tipi casuali. Dopo lo shock termico, posizionare il flaconcino a 25 gradi Celsius per 30 ore con conseguente pupa invecchiata 30 ore dopo la formazione del pupario.
Quindi preparare il terreno di coltura per l'espianto come descritto nel manoscritto del testo e conservare a quattro gradi Celsius. Il giorno dell'imaging, aggiungere siero bovino fetale, soluzione madre di insulina umana e 20 soluzione madre di idrossiedonisano discendere in etanolo in un flaconcino da 50 millilitri contenente 45 millilitri di mezzo Drosophila di Schneider. Mescolare bene e trasferire 15 millilitri del mezzo completo in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e conservare il resto del mezzo completo a quattro gradi Celsius per una settimana.
Quindi coprire l'apertura dei tubi contenenti il mezzo pieno con film di paraffina e ossigenare il mezzo pompando bolle di ossigeno sotto la superficie del liquido attraverso una punta di pipetta sterile da cinque millilitri alla velocità di una bolla al secondo per 20-30 minuti. Quindi, sterilizzare la superficie del pozzo di dissezione e la piastra Sylgard precedentemente preparata con etanolo al 70% e lasciarli asciugare prima dell'uso. Utilizzare un pennello per trasferire 30 ore di pupa APF su una carta velina per asciugare la superficie esterna della pupa per cinque minuti.
Dopo aver applicato del nastro biadesivo su un vetrino, attaccare con cura la pupa essiccata alla superficie appiccicosa del nastro con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Premere delicatamente la pupa con un pennello per fissare correttamente il lato ventrale al nastro senza danneggiare la pupa. Inserire una punta affilata della pinza tra la custodia pupale marrone e la pupa dal lato laterale e rompere con cura la cassa pupale marrone attraverso una linea fino all'estremità posteriore della pupa.
Una volta aperta la custodia pupale marrone, usando la pinza, tenere delicatamente la pupa e trasferirla nel pozzo di dissezione contenente un millilitro di mezzo pieno ossigenato. Immergere la pupa nel mezzo per affondarla sul fondo del pozzo. Per sezionare l'espianto cerebrale dell'antenna dalla pupa, tenere delicatamente la pupa usando una pinza con una mano e usando un paio di microscissori, creare un piccolo foro dal lato posteriore della pupa, che rilascia alta pressione all'interno della pupa.
Partendo dal foro, tagliare attraverso la linea mediana ventrale fino al collo, quindi tagliare la circonferenza del collo per staccare la testa dal corpo della pupa e posizionare il corpo in un pozzo diverso. Quindi, tagliare la cuticola trasparente che copre il lato dorsale del cervello per esporre il corpo grasso sulla parte superiore del cervello, assicurandosi di mantenere la cuticola a cui si attaccano la retina e l'antenna e, allo stesso modo, tagliare la cuticola dal lato ventrale del cervello. Pipettare il mezzo verso le regioni aperte sui lati dorsale e ventrale della testa usando una pipetta P10 per lavare delicatamente il corpo grasso che copre il cervello e l'antenna.
Per studiare l'interazione degli assoni ORN bilaterali o degli assoni ORN al targeting della dendrite PN, tagliare il nervo antennale durante lo stadio posizionando con attenzione le lame dei microscissori tra la cuticola e il cervello e recidere il nervo antennale interessato. Per trasferire l'espianto sezionato sulla piastra Sylgard, posizionare circa 200 microlitri goccioline del mezzo completo ossigenato sulla superficie Sylgard. Pipettare il corpo grasso derivato dal tronco sezionato più volte attraverso una punta di pipetta da 200 microlitri per rivestire la superficie interna per evitare che gli espianti si attacchino alla punta della pipetta durante il trasferimento dal pozzo di dissezione alla goccia media sulla piastra Sylgard.
Utilizzare la pinza per fissare l'espianto sullo strato di Sylgard nei due lobi ottici, quindi posizionare con attenzione la piastra Sylgard sulla stazione di imaging, immobilizzare la piastra con nastri e aggiungere lentamente 10 millilitri del mezzo completo ossigenato alla piastra Sylgard usando una pipetta P1000. Gli assoni ORN arrivano al lobo antennale tra 18 ore e 36 ore APF e poi navigano nel lobo antennale, attraversano la linea mediana e innovano i glomeruli. Prima della registrazione, gli assoni mostravano una deriva laterale mentre il cervello si sviluppava e, dopo la registrazione, la deriva veniva corretta.
Le identità glomerulari degli assoni ORN estratti sono state rivelate dall'immunocolorazione di un marcatore neuropil e della caderina. Confrontando con la mappa del lobo interno, è stato possibile determinare l'identità di ciascun glomerulo. Durante la coltura ex vivo, la crescita dei batteri di solito causa uno sviluppo a riposo del circuito olfattivo.
Pertanto, è importante sterilizzare accuratamente il piatto e i perni culturali prima dell'imaging e mantenere la sala immagini pulita e isolata. Per ottenere una maggiore risoluzione temporale spaziale, questo sistema di espianto può essere ripreso utilizzando un microscopio più avanzato, il microscopio a reticolo a ottica adattiva. Sebbene lo sviluppo di un circuito di fabbrica sia stato mostrato qui come esempio, questo sistema può potenzialmente essere ampliato agli studi di altri circuiti e processi di sviluppo nel cervello centrale in via di sviluppo.
