Il nostro protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per la traduzione senza cellule di Streptomyces venezuelae. Il nostro sistema sfrutta gli enzimi metabolici e le vie di questo organismo non modello. I principali vantaggi sono l'espressione eterologa di geni ad alto contenuto di GC, la fornitura di un ambiente favorevole di inoltro proteico e un sistema aperto per la messa a punto delle vie biosintetiche.
Il nostro metodo aprirà nuove opportunità nello studio dello streptomicesi e dei relativi batteri ad alto GC. Permette di studiare gli enzimi e l'espressione genica in questi batteri. Questa tecnica è stata sviluppata per facilitare l'implementazione da parte di nuovi utenti.
L'unico passo che richiede esperienza o familiarizzazione precedente è la sonicazione per produrre estratti grezzi altamente attivi. Per iniziare a raccogliere le cellule pre-coltivate il terzo giorno, diluire la coltura notturna nel rapporto di uno a 10 con un mezzo GYN fresco per la densità ottica o la misurazione OD a 600 nanometri. Se l'OD della coltura a 600 nanometri è inferiore a 0,3, aumentare la velocità di scuotimento a 250-300 rotazioni al minuto e crescere fino a quando un OD raggiunge 0,3.
Crescere per non più di altre due ore. Se l'OD è maggiore di 0,3, trasferire le colture in contenitori di centrifugazione e raffreddare rapidamente su ghiaccio bagnato per 30 minuti. Mentre aspetti che la coltura cellulare si raffreddi, prepara quattro millilitri di tamponi ditiotreitolo molare fresco, S30A e S30B e tienili sul ghiaccio.
Dopo aver pesato un tubo di centrifuga vuoto da 50 millilitri, pre-raffreddarlo a meno 20 gradi Celsius. Aggiungere due millilitri di un ditiotreitolo molare a un litro di tampone S30A sul ghiaccio e mescolare bene. Centrifugare le cellule a 6.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver scartato il surnatante con un movimento rapido, aggiungere 250 millilitri di tampone S30A e risospescere le cellule scuotendo vigorosamente i flaconi di centrifugazione fino a quando i grumi cellulari sono dispersi in modo omogeneo. Quindi centrifugare nuovamente le cellule per sei minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e ripetere l'aggiunta del tampone S30A, seguita dalla centrifugazione come dimostrato.
Quindi, aggiungere due millilitri di un DTT molare a un litro di tampone S30B sul ghiaccio e mescolare bene. Aggiungere 250 millilitri di tampone S30B alle celle e ripetere la centrifugazione. Risospesare il pellet cellulare in 10 millilitri di tampone S30B e trasferire la sospensione cellulare al tubo centrifugo pre-pesato pre-refrigerato da 50 millilitri.
Se necessario, trasferire le celle residue con altri cinque a 10 millilitri di tampone S30B e riempire il tubo a 50 millilitri di volume con S30B. Centrifugare le cellule per 10 minuti. Scartare il surnatante e ripetere la centrifugazione alle impostazioni precedenti, come dimostrato.
Dopo aver scartato il surnatante, aspirare il surnatante S30B rimanente con una pipetta da 100 a 200 microlitri e pesare il pellet a celle umide. Per ogni grammo di cellule umide, aggiungere 0,9 millilitri di tampone S30B. Risospesce le celle usando una pipetta Pasteur o un vortice.
Centrifugare brevemente per circa 10 secondi fino a 500 G per sedimentare le cellule. Abbassare la punta del sonicatore nella sospensione cellulare fino a quando la punta si trova a circa un centimetro sotto la superficie del liquido. Immettere parametri diversi nelle impostazioni del sonicatore.
Imposta la frequenza su 20 kilohertz, l'ampiezza al 65% del tempo di accensione e spegnimento dell'impulso a 10 secondi e il tempo totale di sonicazione a un minuto. Iniziare la sonicazione e spostare il tubo verso l'alto o verso il basso e lateralmente durante i primi due cicli di riposo per garantire che le celle siano uniformemente sonicate. Se le cellule non sono completamente lisate, invertire il tubo due o tre volte e ripetere la sonicazione per ulteriori cicli di uno o due cicli di 10 secondi con miscelazione frequente fino a quando le cellule non sono completamente interrotte.
Centrifugare le cellule lisate per rimuovere i detriti cellulari, quindi trasferire il surnatante in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri come aliquota di un millilitro. Per la reazione di deflusso degli estratti cellulari, incubare la cellula contenente l'estratto cellulare a 30 gradi Celsius per 60 minuti su un blocco di calore o nell'incubatrice senza uno shaker. Per la reazione trascrizione-traduzione, scongelare la soluzione SMM o MES estratta dalla cellula e il DNA plasmidico sul ghiaccio.
Pre-raffreddare una piastra da 384 pozzetti a meno 20 gradi Celsius. Impostare la reazione trascrizione-traduzione sul ghiaccio dove il 25% del volume è DNA plasmidico, il 33,33% è estratto cellulare e il 41,67% è soluzione SMM. Ruotare delicatamente la miscela per circa cinque secondi a bassa velocità per garantire che la soluzione sia omogenea evitando schiuma o formazione di bolle.
Trasferire tre aliquote di 10 microlitri in tre pozzetti di una piastra da 384 pozzetti come tripliceto tecnico senza introdurre bolle d'aria. Dopo aver sigillato la piastra con un coperchio trasparente, ruotare la piastra a 400 volte G per cinque secondi e incubare la reazione a 28 gradi Celsius in un'incubatrice o in un lettore di piastre senza agitare. La traduzione tra trascrizione senza cellule di Streptomyces venezuelae è stata ottimizzata per l'espressione ad alto rendimento di proteine fluorescenti dal plasmide standard pTU1-A-SP44, nonché di enzimi biosintetici rilevati dall'elettroforesi su gel.
L'espressione del plasmide standard pTU1-A-SP44-mScarlet-I è stata misurata utilizzando diversi metodi. Sono state effettuate le misurazioni di fluorescenza in tempo reale dell'mRNA utilizzando l'aptamero dBroccoli RNA, la proteina mScarlet-I immatura utilizzando il sistema di tag FlAsH e la proteina matura mScarlet-I. La colorazione di fluorescenza in gel di mScarlet-I utilizzando il tag FlAsH è stata condotta in aggiunta alla colorazione Coomassie Blue della proteina totale priva di cellule.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire saggi di attività per studiare enzimi e percorsi che sono difficili utilizzando metodi standard. Si estende anche verso la biosintesi su larga scala e l'espressione genica ad alto rendimento. Stiamo sviluppando questa tecnica per studiare gli enzimi metabolici da batteri ad alto GC.
Abbiamo dimostrato il potenziale del nostro sistema per studiare la biosintesi su larga scala nelle reazioni prive di cellule.
