L'obiettivo di questo metodo è identificare i mutanti nel percorso fotorespiratorio utilizzando uno screening a basse emissioni di CO2. Presentiamo un metodo per identificare i mutanti che interrompono la fotorespirazione dopo l'esposizione a basse emissioni di CO2. Un vantaggio di questo metodo è che si tratta di uno screening ad alto rendimento per le piantine che può essere eseguito in un periodo di tempo relativamente breve.
Le sezioni seguenti forniranno dettagli sulla preparazione e la sterilizzazione delle sementi, la crescita delle piante e il trattamento a basse emissioni di CO2, configureranno il sistema di imaging a fluorescenza, misureranno la resa quantica dei campioni trattati, i risultati rappresentativi e le conclusioni. Preparazione e sterilizzazione delle sementi. La preparazione delle sementi consiste nell'assorbimento e nella sterilizzazione dei semi.
È importante notare che tutti questi passaggi vengono eseguiti in una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni sterili. Tutti i materiali, i reagenti e il terreno di crescita necessari sono sterilizzati in autoclave. Le linee di semi utilizzate sono plgg1-1, abcb26 e WT o wild type.
Assorbire i semi in acqua sterile in una cappa a flusso laminare, quindi stratificare a quattro gradi Celsius al buio per due giorni. In condizioni sterili, preparare 10 millilitri di soluzione di candeggina da volume a volume al 50% e aggiungere circa 20 microlitri di Tween 20. Rimuovere l'acqua dai semi assorbiti, quindi aggiungere un millilitro di soluzione di candeggina nel tubo della microcentrifuga e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Rimuovere la soluzione di candeggina con una pipetta. Risciacquare i semi in un millilitro di acqua sterile per risospendere. Rimuovere l'acqua una volta che i semi si sono depositati sul fondo.
Risospendere i semi in soluzione sterile di agarosio allo 0,1%. Per la placcatura delle sementi, piastre medie basali con 1% di MS di mezzo con vitamine e 1% di agar per la coltivazione dei mutanti di prova. Tagliare una punta di pipetta da 200 microlitri con una lametta da barba.
Utilizzando una pipetta, posizionare un seme al centro della griglia quadrata designata per ciascun mutante o genotipo di prova. Qui viene utilizzata una piastra quadrata con una griglia di uno per un centimetro. Questo aiuta a mantenere una distanza uniforme tra ogni piantina ed evitare sovrapposizioni, che saranno importanti più avanti nell'imaging e nell'analisi della fluorescenza.
Una volta che i semi sono stati placcati, avvolgere il nastro chirurgico attorno al coperchio per sigillarlo, quindi posizionarlo nella camera di crescita. Crescita delle piante e trattamento a basse emissioni di CO2. Coltiva le piante da sette a nove giorni a 20 gradi Celsius sotto un ciclo di luce di otto ore di 120 micromoli per metro quadrato al secondo e 16 ore di oscurità a 18 gradi Celsius.
Controlla le piante il sesto giorno per determinare se sono abbastanza grandi per l'imaging. L'ottavo giorno dopo la placcatura, esporre le piante a basse emissioni di CO2. Posizionare gli impianti di trattamento in una scatola sigillata all'interno della camera di crescita con un'intensità luminosa di 200 micromoli per metro quadrato al secondo per 12 ore.
La condizione di bassa CO2 è stata costruita utilizzando un contenitore trasparente ermetico con 100 grammi di calce sodata posta sul fondo del contenitore. Il contenitore è stato collocato all'interno della stessa camera di crescita del controllo. Gli impianti di controllo rimarranno sotto i 120 micromoli per metro quadrato al secondo nella CO2 ambientale per 12 ore.
Configurare il sistema di imaging a fluorescenza. Posizionare una piastra di prova centrata sotto la telecamera a una distanza fissa nel sistema di imaging a fluorescenza. All'interno del software dello strumento, vai alla finestra live e seleziona la casella Lampeggia per attivare i flash di misurazione non attinici.
Fai clic sugli strumenti di zoom e messa a fuoco fino a visualizzare un'immagine completa e nitida. Impostare il valore dell'otturatore EL a zero e regolare la sensibilità per ottenere un segnale fluorescente nell'intervallo da 200 a 500 unità digitali. Posizionare un esposimetro nella stessa posizione utilizzato per regolare le impostazioni della fotocamera.
Nella finestra animata, seleziona la casella Super per avviare un impulso di saturazione della durata di 800 millisecondi. Utilizzare il cursore per regolare la percentuale di potenza relativa per l'impulso Super fino a quando l'esposimetro legge da 6.000 a 8.000 micromoli per metro quadrato al secondo. Misurare la resa quantica dei campioni trattati.
Subito dopo il trattamento, coprire le piastre con un foglio di alluminio per 15 minuti per l'adattamento al buio. Rimuovere la pellicola per misurare la resa quantica del fotosistema due con un fluorometro modificato con ampiezza dell'impulso. Quindi posiziona la piastra della piantina direttamente sotto la fotocamera ed esegui il protocollo di resa quantistica trovato nel nostro repository GitHub.
Scarica il protocollo Quantum Yield da GitHub. Utilizzare un software fluorometrico per aprire il file di programma facendo clic sull'icona della cartella e navigando verso il percorso del file. Esegui il protocollo di resa quantistica facendo clic sull'icona del fulmine rosso.
Al termine del protocollo, passare alla finestra di pre-analisi. Partizionare il piatto in singole piantine evidenziando tutti i pixel per ogni piantina sull'immagine del piatto. Fate clic su Esclusione sfondo per rimuovere tutti i pixel di sfondo evidenziati, lasciando solo l'area della piantina.
Fare clic su Analizza per generare dati di fluorescenza per ogni piantina sull'immagine della piastra. Regolare manualmente l'intervallo dei valori di fluorescenza per visualizzare valori minimi e massimi coerenti tra tutte le piastre. Nella scheda Esperimento, fai clic su Esporta, quindi su Numerico.
Clicca su Media numerica per generare un file di testo contenente la resa quantica per ogni piantina. Aprire il file di testo e il foglio di calcolo per l'analisi. Il foglio di calcolo contiene il numero di area, la dimensione dei pixel, Fm, Ft, Fq e QY. In primo luogo, dobbiamo identificare il numero di area al suo genotipo corrispondente, se wild type o un mutante di prova, Risultati.
Ecco le immagini delle lastre di immagini grezze e fluorescenze dallo screening ambientale e a bassa CO2 di tipi selvatici e mutanti di prova. Ogni piastra è etichettata per numero di area con letture di fluorescenza corrispondenti come resa quantica o QY. I dati vengono esportati come file di testo e possono essere aperti in un foglio di calcolo per l'analisi. Le efficienze di resa quantistica Fv/Fm adattate al buio dei tipi selvatici e dei mutanti sono visualizzate da grafici a scatola e baffi.
Per testare la differenza statistica dei wild type e dei mutanti di prova, è stato utilizzato il T-test a coppie con un valore P inferiore a 0,05. Qui, utilizziamo la linea mutante fotorespiratoria con resa quantica ridotta Fv / Fm come mutante di prova per verificare l'efficienza del nostro metodo di screening. I nostri risultati mostrano che i mutanti di prova hanno un'efficienza di resa quantica significativamente inferiore rispetto ai tipi selvatici.
Ciò indica che il nostro metodo di screening è in grado di identificare i mutanti fotorespiratori utilizzando uno screening a basse emissioni di CO2. Conclusioni. Una cosa importante da ricordare durante l'utilizzo di questo protocollo è assicurarsi che le piantine di Arabidopsis siano abbastanza grandi da misurare la fluorescenza, ma non così grandi da sovrapporsi durante l'imaging. Si preferisce immaginare le piantine come le prime vere foglie per cercare di mantenere uniformi le dimensioni delle foglie e gli angoli delle foglie.
Questo protocollo può essere utilizzato come screening ad alto rendimento per le piantine. L'imaging di ogni piastra è relativamente veloce e ha il potenziale per lo screening di oltre 1.000 piantine al giorno. L'analisi della fluorescenza della clorofilla ci ha permesso di identificare i mutanti fotorespiratori utilizzando uno screening a basse emissioni di CO2, importante per mantenere l'efficienza della fotorespirazione.
Questo protocollo non è limitato ad Arabidopsis e ha il potenziale utilizzo per esperimenti di risposta allo stress abiotico.
