I metaboliti rilasciati dal microbiota intestinale producono effetti complessi sull'ospite. Questo protocollo presenta un metodo per interrogare il ruolo dei metaboliti intestinali nel cervello e nel comportamento del topo. Questa tecnica fornisce un metodo preciso, meticoloso e convalidato per fornire metaboliti intestinali in un cervello in topi che si muovono liberamente.
Forniamo una metodologia completa e fisiologica migliore per la comprensione della ricerca sull'asse del cervello intestinale. Posizionare il mouse sul telaio stereotassico e fissare gli incisivi del mouse sulla barra incisiva nel supporto dell'incisivo stereotassico. Coprire il naso con la maschera del cono del naso.
Quindi valutare la nocicezione del topo attraverso il riflesso del pizzico superiore e garantire una frequenza respiratoria costante prima di incidere il sito chirurgico. Una volta che la pelliccia tagliata sulla testa viene rimossa dal nastro adesivo, iniettare per via sottocutanea il ketoprofene analgesico per alleviare il dolore e applicare un unguento per gli occhi. Quindi, fissare la testa inserendo la barra auricolare appuntita nel condotto uditivo.
Stringere il morsetto del naso sul supporto dell'incisivo e premere delicatamente la testa per assicurarsi che la testa sia fissa. Utilizzare 3 scrub alternati di tampone alla clorexidina per disinfettare il cuoio capelluto. Ora, usa bisturi dissezionante per fare un'incisione di meno di un centimetro nel cuoio capelluto in modo posteriore anteriore.
Dopo aver aperto l'incisione, pulire il cranio con un batuffolo di cotone tenuto da una pinza micro dissecante. Sulla base delle coordinate stereotassiche, identificare ed etichettare la posizione del ventricolo laterale destro come descritto nel manoscritto. Quindi, praticare un foro attraverso il cranio nel sito etichettato usando un trapano stereotassico, e più tardi, praticare da due a quattro fori nel cranio.
Pulire il cranio con un batuffolo di cotone alla lidocaina e montare da 2 a 4 viti in acciaio inossidabile sui fori. Posizionare la cannula guida commerciale sul supporto della cannula stereotassica e disinfettare con lo sterilizzatore a velocità di vetro a 150 gradi Celsius. Quindi, spostare il supporto della cannula stereotassica sul foro praticato per il ventricolo laterale e inserire lentamente la cannula di guida commerciale nel foro fino a raggiungere la profondità desiderata.
Ora applicare 10 microlitri di adesivo n-butile cianoacrilato per fissare la cannula guida commerciale nel foro praticato e attendere 3 o 4 minuti. Rilasciare delicatamente la cannula guida commerciale dal supporto della cannula stereotassica e applicare l'acrilico dentale sul cuoio capelluto inciso per fissare la cannula guida commerciale e attendere almeno 5 minuti. Impiantare il manichino commerciale nella cannula della guida commerciale.
Quindi, posizionare il mouse in una nuova gabbia con una piastra riscaldante sotto per il recupero dall'anestesia e osservare continuamente fino a quando il topo non si risveglia completamente. Montare la siringa da microlitri, contenente 10 microlitri di acqua distillata, sulla pompa di microiniezione. Utilizzando una siringa da insulina, riempire il tubo di polietilene con acqua distillata e collegare la siringa da microlitro al tubo di polietilene sospeso.
Accendere il controller di microiniezione e premere display tutti i canali per accedere alla schermata di comando. Quindi, premere configurazione e impostare l'obiettivo del volume su 9.800 nanolitri con velocità di consegna di 100 nanolitri al secondo. Quindi premere la direzione per passare alla modalità di infusione e premere Run per infondere 9.800 nanolitri di acqua distillata dal tubo di polietilene collegato alla siringa da microlitro.
Ora, posizionare l'iniettore in una fiala contenente l'olio minerale, premere la configurazione e impostare l'obiettivo di volume su 3.000 nanolitri con velocità di erogazione a 100 nanolitri al secondo. Per prelevare 3.000 nanolitri di olio minerale, premere la direzione per passare alla modalità di prelievo e quindi premere Esegui. Smontare il tubo di polietilene dall'ago della siringa da microlitri.
Per sputare 3.000 nanolitri di acqua distillata dall'ago della siringa da microlitri, premere la direzione per passare alla modalità di infusione e premere run. Quindi inserire nuovamente la siringa da microlitro nel tubo di polietilene. Inserire l'iniettore in un flaconcino contenente SCFA.
Premere la configurazione e impostare l'obiettivo del volume su 9.500 nanolitri con velocità di consegna a 100 nanolitri al secondo. Prelevare 9.500 nanolitri di SCFA premendo la direzione per passare alla modalità di prelievo e premere Esegui. Etichettare la fase SCFA dell'olio per verificare se gli SCFA sono stati infusi correttamente.
Premere la configurazione e impostare l'obiettivo di volume desiderato con velocità di consegna a 7 nanolitri al secondo. Premere la direzione per passare alla modalità di infusione. Premere per infondere la siringa da microlitro in avanti fino a quando il liquido esce all'estremità anteriore dell'iniettore commerciale prima di inserire l'iniettore nella cannula per l'iniezione di SCFA.
Dopo aver anestetizzato il mouse, inserire l'iniettore commerciale nella cannula della guida commerciale. Una volta che il topo è guarito dall'anestesia, mettilo in una nuova gabbia e lascialo esplorare per 35 minuti liberamente. Infondere SCFA utilizzando una velocità di consegna di 7 nanolitri al secondo per un volume target di 2.100 nanolitri nei primi 5 minuti.
Quindi premere la direzione per la modalità di infusione e premere Esegui. Dopo i test comportamentali, rimuovere l'iniettore commerciale dalla cannula della guida commerciale. Infondere 2.100 nanolitri del tracciante neutro con la velocità di erogazione di 7 nanolitri al secondo per verificare il sito di infusione.
Visualizzare il segnale fluorescente nel sito di infusione utilizzando un microscopio a fluorescenza. Entrambi i topi infusi con ACSF e SCFA hanno viaggiato in una nuova gabbia per un totale di 35 minuti. Non è stata osservata alcuna differenza nell'attività locomotoria nella nuova gabbia tra infusione di SCFA e ACSF.
Il colorante fluorescente è stato rilevato nel ventricolo laterale e nelle regioni circostanti del cervello del topo quando è stato infuso con una cannula guida commerciale. Allo stesso modo, l'infusione attraverso la cannula di guida in acciaio inossidabile porta alla rilevazione di segnali nel ventricolo laterale e nelle regioni circostanti del cervello del topo. La combinazione di questa procedura con tecnologie neurali basate su circuiti consentirà agli scienziati di ottenere informazioni sul controllo del cervello basato sul circuito e sul comportamento fornito dai metaboliti intestinali.
Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare il ruolo del microbiota e dei metaboliti nell'intricato asse cerebrale intestinale.
