Nei batteri, lo studio della dinamica delle proteine di divisione cellulare richiede un orientamento spaziale delle cellule. Ad esempio, nel caso dell'anello Z, il componente principale nella divisione cellulare batterica, un orientamento verticale è fondamentale per registrare l'intera struttura nel piano XY. In questo video, sviluppiamo un metodo per ottenere questo particolare orientamento nei cianobatteri filamentosi Anabaena.
Anabaena è un organismo fotosintetico multicellulare e condivide con altri batteri la capacità di utilizzare il diazoto atmosferico come fonte di azoto. In assenza di questo elemento, Anabaena differenzia le cellule specializzate nella fissazione dell'azoto. Pertanto, fornisce un modello eccellente in cui analizzare la relazione tra divisione cellulare e multicellularità.
In primo luogo, selezionare un componente divisorio presente nel ceppo cianobatterico filamentoso bersaglio. Per l'esperimento, è necessario costruire un mutante cianobatterico filamentoso che esprima la componente divisiva selezionata fusa in una proteina fluorescente. In questo protocollo, usiamo un mutante Anabaena che esprime FtsZ fuso a GFP come esempio.
In primo luogo, creare una nuova sottocultura del mutante con 10 millilitri di una coltura in fase stazionaria e 90 millilitri di mezzo liquido. Quindi coltivare la nuova coltura cellulare in luce costante e alla temperatura ottimale, fino a raggiungere la fase esponenziale. Nel nostro esempio, il mutante è cresciuto a 25 gradi Celsius per sette giorni.
Ora prendi due millilitri della coltura di crescita e mettila in un tubo da centrifuga. Centrifugare a 2.500 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, controllare che tutte le celle siano sul fondo del tubo.
Prestare attenzione durante la manipolazione dei campioni, per evitare la risospensione. Riscaldare la soluzione di agarosio a basso punto di fusione al 3% in un forno a microonde. È importante farlo in brevi intervalli di tempo e controllare la soluzione fino a completa liquidità.
Una volta sciolto, mettere da parte per raffreddare. Prendi le provette della centrifuga del passaggio precedente, scarta 1,9 millilitri di surnatante e risospendi le celle nel volume rimanente pipettando almeno tre volte su e giù. Sul posto di lavoro, metti il tubo con le cellule, la soluzione di agarosio fuso, una siringa da un millilitro tagliata nella punta e un bisturi con una lama nuova e pulita.
Quindi mescolare le cellule con 900 microlitri della soluzione di agarosio al 3% pipettando almeno tre volte. È molto importante assicurarsi che la soluzione di agarosio non sia troppo calda, ma rimanga liquida. Con questo, stiamo evitando danni alle cellule durante questo processo.
Il prossimo passo deve essere fatto velocemente e prima che la soluzione di agarosio gelifici. Aspirare la matrice di agarosio in una siringa da un millilitro, con attenzione. È importante evitare la generazione di bolle mentre il campione viene aspirato.
Successivamente, incubare il campione, mettendo la siringa in posizione orizzontale a temperatura ambiente per due ore. Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione la matrice con le cellule usando lo stantuffo in una superficie pulita e piana. Usando il bisturi, tagliare il campione di gel a fette il più sottili possibile, mantenendo l'integrità della matrice.
Quindi depositare i campioni nel foglietto corrispondente, fianco a fianco. Come mostrato nel video, in questo passaggio, è possibile utilizzare un suggerimento per assistere nel processo di gestione del campione. Per gli esperimenti time-lapse, si raccomanda l'uso di una camera cellulare fatta per l'analisi al microscopio.
In questo caso, utilizziamo copertine circolari che si adattano a questo tipo di camere, come puoi vedere nel video. Infine, per prevenire la disidratazione del campione, aggiungere un volume extra di soluzione fusa di agarosio al 3% all'interno della camera. Prima di immaginare, attendere che l'agarosio sia completamente gelificato.
Ora metti la camera con le cellule nel microscopio per l'imaging. Si consiglia di utilizzare un'apparecchiatura con controllo della temperatura e dell'umidità. Visualizza il campione in campo luminoso con il massimo ingrandimento e cerca un filamento orientato verticalmente.
È possibile trovare il sito di divisione di interesse con una scansione iniziale utilizzando il segnale di autofluorescenza lungo il piano Z. Con questo, usa i parametri del tuo marcatore proteico fluorescente per visualizzare il segnale della tua proteina di interesse nel sito della divisione. Ora è possibile eseguire esperimenti time-lapse in base al modello biologico e alla proteina di interesse.
In questo caso, possiamo vedere l'intera struttura dell'anello Z nel mutante FtsZ-GFP, nel piano XY. Con il nostro metodo, siamo stati in grado di registrare la dinamica di questi anelli in un lungo periodo di tempo. Infine, con i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza, concludiamo che questa struttura è altamente dinamica nel nostro modello.
Questo metodo è un protocollo rapido ed economico per registrare la dinamica proteica nel sito di divisione mediante microscopia confocale applicata a morfologie complesse come i cianobatteri filamentosi, utilizzando Anabaena come modello.
