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要約

フローサイトメトリーを用いた細胞結合の試金を記述、CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) に蛍光に分類された CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12) の結合を阻害する化合物を同定するスクリーニング用具として主に使用される種類の流れ。

要約

G タンパク質共役受容体 (Gpcr) の薬理学的対象は、人間の健康に非常に重要な多くの病気の進行に貢献する機能不全 GPCR を介したシグナル伝達します。リガンド ・受容体ペア CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12)/CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) がんや炎症性疾患の治療のための潜在的なターゲットとして、例えば重要な臨床的関心を調達しています。特に CXCR4 をターゲットし、受容体の機能を阻害する抗体と同様、小分子と見なされる薬理学的に貴重なツールをします。ここでは、フロー フローサイトメトリーを用いた細胞試金 CXCR4 に cxcl 12 バインディングを破棄する化合物 (例えば、小分子) の同定を可能にするを説明します。基本的には、アッセイは、受容体 CXCR4 の自然ケモカイン アゴニスト蛍光に分類された cxcl 12 の固定量とラベルのない化合物の結合のための競争に依存します。したがって、このアッセイで放射能によって分類されたプローブの望ましくない使用は避けます。さらに、生きている細胞は、細胞膜の準備ではなく受容体 (CXCR4) のソースとして使用されます。これによりスループットが向上版のフォーマットにアッセイの容易に適応できます。この試金は CXCR4 ターゲット化合物を識別するために貴重なジェネリック医薬品検出アッセイする示されています。プロトコル可能性がありますに対応できる他の Gpcr 少なくとも蛍光リガンドは利用または生成することができるかどうか。これらの Gpcr の活性化により誘導される細胞内シグナル伝達経路に関する事前の知識は必要ありません。

概要

G タンパク質共役受容体 (Gpcr) はセル表面蛋白質 (例えばペプチド、タンパク質ホルモン類、アミン) 細胞外リガンドによって活性化することができます、1を処理により多くの生理学的発達を調節します。受容体蛋白質の誘起構造変化が細胞内受容体関連ヘテロ三量体 G タンパク質の Gαから成る結合を促進するアゴニストは、GPCR 結合ポケットを占めていると、GDP と Gβγサブユニット。解離、下流を開始するさらに G 蛋白質サブユニット (GαGTP と Gβγ) の Gαサブユニット結果に GDP を GTP のそれ以降の exchange はシグナリング経路2,3です。GαGTP が加水分解したとき再会 Gαの GDP と Gβγサブユニット G タンパク質戻るに変換その静止の状態3,4。G タンパク質の異なる種類が存在 (GsG のi/oGq、G12/13) を Gαサブユニット5配列の類似性に基づいて分類されます。すべてのこれらの G タンパク質は受容体活性化する生物学的反応の根底にある定義済みの細胞内シグナル伝達経路を誘発します。受容体活性化後は、GPCR キナーゼ (GRKs) は、β arrestins との相互作用の促進を図る、Gpcr の細胞内の尾をリン酸化します。このプロセスは、G タンパク質シグナル伝達、受容体の脱感作と内面の6の終了に します。Β arrestins、トリガー信号をカスケード G 蛋白質シグナリング7の独立した多分子複合体の一部です。

Gpcr は、治療的介入のほとんどの検証分子標的の中で多くの病因学に貢献する規制を解かれた GPCR を介したシグナル伝達、例えば機能獲得変異受容体遺伝子の受容体の過剰発現が原因人間の病気の8。したがって、Gpcr は製薬業界8,9,10を用いて創薬ターゲットの最も重要なクラスの 1 つを表します。臨床的に関連する GPCR の顕著な例は CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4)、唯一の天然リガンド、CXC ケモカイン配位子 12 (cxcl 12)11によって活性化することができます。(HIV-1) ひと免疫不全ウイルス 1 の主要な共受容体として確立された役割のためのエントリ、クラスターの分化 4 (CD4) 抗ウイルス薬ターゲットとして肯定的な T リンパ球12, CXCR4 を調べた最初の感染。さらに骨髄に cxcl 12 CXCR4 相互作用調節保持し幹・前駆細胞のホーミング細胞13。また、がん生物学 (例えば、腫瘍細胞の生存、転移、腫瘍関連血管新生)14の多くの側面でいくつかその他疾患 (例えば、炎症性疾患)15, CXCR4 の関与を考える創薬のための有望なターゲットとして大きな関心を発生します。AMD3100, CXCR4 を標的とする低分子抗 HIV 薬候補16として発見された当初はまだ日付17に記載されている最も強力な CXCR4 アンタゴニストの一つ.その開発と抗ウイルス薬は、しかし、18は中止。現在この分子は、多発性骨髄腫とリンパ腫の患者のための18の治療中に幹細胞動員エージェントとして使用されます。いくつかの他の化学的に無関係な小さな分子や CXCR4 関数をさまざまな効力を抑制する生物学的製剤は、記述されている19をされています。

受容体結合メソッドは、関心の GPCR と直接対話する化合物 (例えば、小分子) を識別できるように薬理学の貴重なツールです。結合試験を実行するために、細胞内シグナル伝達のプロパティまたは特定の GPCR の機能に関する知識の必要はありません。これは利点であるためと考えられることができます、それは化合物が受容体の結合を示すことができますがさらに彼らの潜在的な敵対または敵対的活動を評価することによって特徴付けられる必要があることを意味します。この活動は、GPCR 研究の下に関連する薬理学的または生物学的アッセイを使用して評価できます。彼らの活動のプロファイルに依存して、受容体の結合の分子、潜在的になる進化可能性前臨床試験と臨床研究の調査のための新規リード化合物。高親和性受容体に特異結合する分子が腫瘍細胞20の生体内非侵襲イメージングのカイネティックスそれらによって例えば治療または診断ツールを生成するための足場として、または可能性としても利用できます。治療21のターゲットを絞った配信のための車。CXCR4 の場合腫瘍細胞の生体内イメージングが既に実証されているラベル CXCR4 ターゲット分子がひと癌異種移植片20,22,23 の視覚化を許可する前記マウスモデルを使用して.

本報告では、小分子と CXCR4 を拘束アゴニスト (cxcl 12) に直接干渉する生物学的製剤の照合することにより競争の結合の試金のための詳しいプロトコルについて述べる。アッセイの原理は蛍光リガンドの固定量間の競争 (cxcl 12AF647テーブルの材料および試薬を参照してください) と受容体タンパク質17,にバインドするための化合物をラベル24. CXCR4 を表現する 1 つのセルにバインドされている標識リガンドから特定の蛍光シグナルは、フローサイトメトリーで分析しました。ラベルのない小さな分子 cxcl 12AF647と CXCR4 相互作用を混乱させるとき、この蛍光信号を差し引かれます。アッセイは、内生 CXCR4 を表現する非操作の細胞を使用して (すなわち、 Jurkat 細胞)。したがって、細胞膜の準備する必要がない便利な高速、スループットの向上と互換性のある試金になります。蛍光リガンドを利用していますので、放射能を避けます。

Cxcl 12 は CXCR4 の自然のアゴニスト、cxcl 12AF647バインディング アッセイに干渉する低分子化合物は orthosteric 受容体結合部位 (すなわち、結合部位が占め、自然と対話するにはアゴニスト)。Orthosteric 結合部位とは異なる地形的受容体結合部位と通信できる分子が気づかれ場合 cxcl 12 のバインディングには影響しません。例えば、このアッセイでの正と負のアロステリック変調、GPCR アロステリック結合サイト25に作用する分子をターゲットの重要な新たなカテゴリをピックアップされている可能性。さらに、受容体アンタゴニストやアゴニストとして化合物がこのバインディング アッセイ機能を識別されるかどうかは派生できません。その他、薬理学的または機能的受容体関連アッセイで同定された化合物の調査は従って必要となります。これらの試金は (の組み合わせ) を含めることが第二使徒 (例えばCa2 +、環状アデノシン一リン酸 (cAMP))、表現型の検出細胞蛍光または発光ベース法または生物学的アッセイと β アレスチン募集の試金、どちらを調査の下で GPCR の特定信号プロパティによって異なります。したがって、主に本明細書に記載されている競争の結合の試金は、受容体結合能を持つ化合物の詳細な特性評価を有効にする他の細胞に基づく試金で補完する必要がある最初のスクリーニング法として機能します。

プロトコル

1. 培養細胞のメンテナンス

注: 1 と 2 で説明したすべてのステップ キャビネット層流無菌条件の下で実行されます。

  1. 加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でコート t75 フラスコ培養フラスコのセルを育てます。
    注: このアッセイで Jurkat 細胞 (すなわち、内生表現 CXCR417ひと白血病細胞の T リンパ球細胞) が使用されます。CXCR4 の細胞表面での発現をフローサイトメトリーによる細胞培養中で評価されるべき。流れ cytometry プロシージャおよび細胞表面の受容体の発現レベル、ただし、このプロトコルの範囲内ではされているを決定する試薬の説明上記17の。
  2. Jurkat 細胞の成長停止の 80-85% に到達するまで合流しましょう。新規フラスコにセルを通過する前に部屋の温度 (RT) に到達するすべての試薬を許可します。
  3. 新しいコート t75 フラスコ培養用フラスコに完全な新鮮な成長媒体 (RPMI 1640 中, 10% 牛胎児血清 (FBS)、2 mM グルタミン) の 20 mL を追加します。
  4. 小説コート t75 フラスコ培養用フラスコに (細胞懸濁液 25 mL を含んでいる) 元の T75 フラスコから Jurkat 細胞懸濁液 5 mL を追加します。37 ° C、5% CO2加湿インキュベーターで孵化させなさい。

2. cxcl 12、アッセイのバッファー、および Jurkat 細胞の競争の結合の試金のための準備。

  1. ポリソルベート 20 の 0.01% (ボリューム) を添加した純水 (暗闇の中、-80 ° C で保存) 凍結乾燥試薬を溶解することにより cxcl 12AF647 (20 μ G/ml; 参照テーブルの材料および試薬) の原液を準備します。単一のストアは、-80 ° c、光から保護されてこの原液から因数を使用します。
  2. 40 mL HEPES (1 M、20 mM 最終濃度) を追加することにより 200 mL ハンクのバランスのとれた食塩 (HBSS、10 x、フェノールレッドと重炭酸ナトリウム、最終濃度 x 1 なし) にアッセイバッファーを準備します。追加純水 2 l. 追加 4 g (0.2% 重量/容積) ・ ウシ ・血清アルブミン (BSA) の最終的なボリュームを取得して磁気を介して BSA を溶解攪拌。最後に、7.4 (これに水酸化ナトリウムを使用) に pH を調整し、(テーブルの材料および試薬を参照) 0.2 μ m の気孔を通してソリューションをフィルター真空多岐管を使用しています。
    注: このアッセイバッファーはプロトコルのすべての以降の手順で使用されます。
  3. 細胞の生存率と数をカウントします。このため、細胞の懸濁液のサンプルを取るし、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈します。
    注: 我々 は日常的に自動化された細胞生存率アナライザーを使用 (テーブルの材料および試薬を参照) さまざまな濃度で細胞を懸濁液を数えることができます。セルがカウントの 1.5 mL の PBS (例えば、 1.9 mL の PBS に 0.1 mL その他の希釈も可能です) に細胞懸濁液 0.5 mL を希釈します。トリパン ブルー色素排除法に基づいて、このメソッドの使用されている前述した26。携帯番号と同様に動作する必要があります可能性を数えるため市販されているいくつかの他のデバイス。
  4. 400 の x g で 5 分間遠心分離 (遠心分離機のタイプの材料および試薬の使用を参照) によって滅菌 50 mL のチューブで細胞 (すなわち、 ~ 24 x の 1 つの完全な 96 ウェル プレートでアッセイを実行する 10 の6セル) の必要な数を収集します。RT。
  5. 細胞ペレットを乱すことがなく上澄みをそっと注ぐ。新鮮なアッセイバッファーを追加 (例えば、 20 mL) と上下に軽くピペッティングにより細胞を再懸濁します。
  6. 室温 5 分 400 x g で再び細胞を遠心分離します。
  7. もう一度、上澄みを離れて注ぎ、5 x 106セル/ml の密度を得るため新鮮なアッセイバッファーで細胞ペレットを再懸濁します。

3 競争の結合の試金

注: 実際の競争の結合の試金は RT では実行され、非無菌条件の下で実行することができます。

  1. アッセイバッファーで調査中で化合物を希釈 (2.2 参照) 望ましい集中を取得します。いずれか準備初期スクリーニング (例えば10 μ M 最終濃度) の化合物濃度が固定または濃度の連続希釈系列化合物のキャラクタリゼーションの詳細 (例えば1/3、1/4、1/5 希釈系列最終濃度 1 μ M から始まる)。複合ソリューションの 2 倍希釈で試金; 最終的になる覚えておいてください。したがって、濃縮された溶液 x 2 を準備します。
  2. 底板ラウンド クリア 96 ウェルに 100 μ L の混合の解決 (濃縮 2 倍) を分配 (テーブルの材料および試薬を参照) (例えば図 1) を事前に定義された実験的レイアウトによると。
    注: この段階では、正と負のコントロールのサンプルは分析に含まれます。否定的な制御サンプル96-well 版の井戸に化合物の代わりにアッセイバッファーの 100 μ L が追加されます。肯定的な制御サンプルアッセイバッファーがこのステップの間にも追加されます。いくつかの化合物の希釈系列をテストの典型的な実験的レイアウトには、図 1を参照してください。
  3. 細胞懸濁液を 50 μ l 添加 (2.7; を参照してください 106セル × 0.25) マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートに試薬リザーバーから。暗闇の中で常温 15 分間プレートを孵化させなさい。
  4. 50 μ L の蛍光に分類された cxcl 12 を追加 (すなわち、 100 ng/mL 25 ng/mL の最終的な集中、集中 4 x アッセイバッファー cxcl 12AF647の) 96 ウェル プレートの井戸に類似した試薬槽から。暗闇の中で室温で 30 分間インキュベートします。
    注:否定的なコントロールのサンプルは、アッセイバッファーを代わりに追加します。したがって、マイナス コントロールのサンプルで検出された蛍光シグナルは蛍光バック グラウンド信号 (図 1 a) に対応します。肯定的な制御サンプルcxcl 12AF647の 50 μ L/ウェルを追加します。肯定的な制御サンプル最大蛍光信号を検出、含まれている化合物と前の孵化によって潜在的な阻害がなかったので (図 1 a) が得られます。
  5. 板の上を反転して削除した小球形にされた細胞から培養上清で 5 分間 400 x g で 96 ウェル プレートを遠心します。組織にプレートを乾燥させます。
  6. マルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に試薬リザーバーから新鮮なアッセイバッファー 200 μ L を追加します。すぐに進みます。
  7. 板の上を反転して削除した上清で 400 × g で 5 分間再びプレートを遠心し、再び組織上で乾燥させます。
  8. 軽く 200 μ L の PBS に溶解し 1% パラホルムアルデヒドで細胞ペレットを再懸濁します。この手順では、セルを修正します。
  9. フローサイトメトリーによる蛍光性の定量化とすぐにプロトコルを続行します。

4. フローサイトメトリーによる試料の分析

Cxcl 12AF647ステンドし、執着の細胞をフローサイトメトリーを使用して分析する準備が整いました。流れの cytometers のいくつかの種類を使用できますが、彼らは励起および蛍光検出のための適切なフィルター (すなわち、赤いレーザー、励起 〜 630 nm)、適切なレーザーを装備する必要がある (発光フィルター 〜 660 nm)。彼らは 96-well 版のフォーマットのサンプルを処理できる必要があります。適切な流量フローサイトメトリー デバイスの例としてテーブルの材料および試薬で与えられます。

  1. デバイスを起動し、対応するソフトウェアを開きます (テーブルの材料および試薬を参照)。
  2. ドットのしみ形式で可視化すること次の細胞パラメーターを選択: 散布 (FSC)、側方散乱 (SSC) および蛍光 (cxcl 12AF647) 検出チャンネルを転送します。
    注: FSC パラメーターを持つ細胞が差別されるのサイズに基づいて検出された光吸収セルの直径に比例しているので。90 ° の角度で光の散乱を測定、SSC パラメーターは、セルの粒度に関する情報を提供します。
  3. FSC と SSC のパラメーターに基づいて定義された均一な細胞集団のゲートを実行する (例えば、否定的な制御サンプル) 1 つのサンプルを選択します。
    1. この否定的な制御サンプルから流れの cytometer に執着細胞の ~ 100 μ L の自動注入を選択します。オプション「混合」投与前に、を選択し、1.5 μ L/s のサンプル フロー レートを使用します。
    2. 「取得データ」を選択することでこのサンプルを実行このサンプルの FSC と SSC のパラメーターが画面に表示されます。
    3. ソフトウェアのゲーティング ツールを選択します。FSC と SSC ドットのしみの可視化に基づく、事前ゲートで均質かつ実行可能な細胞集団を定義します。これを行うには、これらの 2 つのディメンションに基づくゆく分散単一セル (「イベント」) が含まれる (ソフトウェアのゲーティング ツールを使用して) 多角形を作成します。
      注: ゲーティングの手順は、さらに分析に使用する同種および実行可能なセル人口を定義を目指しています。ゲートは、生菌の大半が FSC と SSC のパラメーターに基づいて均一な細胞集団を形成する仮定に依存します。この手順を実行すると、主細胞の残骸、死んだ細胞、細胞凝集塊をさらに分析から除外することができます。ゲーティング プロセスの図は、図 1 bで与えられます。
  4. 20,000「イベント」(すなわち、単一セル) サンプルあたりを分析するを選択します。
    注: これは、各サンプルでは、定義済みのゲート内にある 20,000 の細胞が最終的に分析することを意味します。各サンプルのデータ集録は、このイベントの数の分析まで続行されます。
  5. 実行 (選択「記録データ」) を開始。流れの cytometry デバイスは各サンプルの平均蛍光強度 (MFI) を記録することによって 1 つのすべてのサンプルを分析します。この MFI は、定義済みのゲート内にある 20,000 のセルに対応する平均蛍光信号に対応します。

5. データの解析

さらに計算を実行するのに各サンプルの得られた MFI を使用します。流れの cytometry データの解析は、(表の材料および試薬を参照)、いくつかの市販のソフトウェア パッケージによって実行できます。

  1. 割合を決定する化合物の前培養の結果、蛍光バインディング信号の抑制は次の数式を適用します。
    figure-protocol-5875
    どこ：
    MFIExp (= 化合物処理) 実験の MFI を = サンプル
    MFIPC肯定的な制御の MFI を =
    MFINC = 陰性対照の MFI
  2. 化合物 (すなわち50% によって蛍光結合信号を減らすことができる化合物の濃度) の IC50値を調べるには、次の数式を適用します。
    figure-protocol-6192
    どこ：
    ログconc.2 = 50% 未満になる化合物の濃度のログ PC と NC の MFI の値の差の抑制
    ログconc.1 = 50% 以上の化合物の濃度のログ PC と NC の MFI の値の差の抑制
    注: また、高活性化合物の場合大きさのいくつかのログをカバー用量-反応曲線生成できます各テスト化合物濃度に対応する MFI に基づきます。適切なソフトウェアを使用して非線形回帰曲線のあてはめを適用することによって (テーブルの材料および試薬を参照)、IC50値を生成された曲線から推定しことができます。この分析手法の例は、図 3に示します。

結果

結合の試金の一般的なワークフローは、図 1 aに提示されます。図 1 bと可能なプレート レイアウトを実行する (すなわち、否定的な制御、肯定的な制御と実験的サンプル) 標準的な実験の別のサンプル タイプの得られた流れ cytometry データの種類のイラストが描かれています。96 ウェル プレート形式のアッセイは、

ディスカッション

結合の試金 (すなわち、飽和結合と動的バインディング実験) の他のタイプと比較して、競争の結合の試金は、スクリーニング目的に最も適しています。確かに、彼らは定額ラベル付き受容体リガンドの結合を妨害する能力の得点でラベルのない化合物、例えば小さい分子の大規模なバッチの評価ができます。標識リガンドよりも他の受容体部位に結合する化合物は、アッセイの検出さ...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、優れたテクニカル サポートにエリック ・ フォンテーンを感謝したいです。この作品は、ルーヴェンに支えられている (no を付与します。PF/10/018)、フォンや Wetenschappelijk Onderzoek (FWO、いいえを付与します。G.485.08) と財団ドルムール ファドゥーツ。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
BD FACSCanto IIBecton DickinsonNot applicableFlow cytometry device
BD FACSDIVA Software
BD FACSArrayBecton DickinsonNot applicableFlow cytometry device
BD FACSArray System Software
Graphpad PrismGraphpadsoftware package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3
FlowJoFlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.
Vi-CELLBeckman CoulterNot applicablecell viability analyzer
Sigma 3-18 KSSigmaNot applicablecentrifuge
AMD3100SigmaA5602-5mgspecific CXCR4 antagonist
MaravirocPfizerantiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647)ALMACCAF-11-B-01fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA1933-25G
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol redGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1M)Gibco (Life Technologies)15630-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Jurkat cellsATCC
Reagent reservoir PPSigmaBR703411
Rapid flow filter: 0.2 µm aPESThermo Scientific566-0020
Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clearThermo Scientific611U96
Falcon tubes, 50mlGreiner Bio-One227 261
Tissue culture flask (T75)Corning353024

参考文献

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