CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험

요약

한 흐름 cytometry 기반 셀룰러 바인딩 분석 결과 설명 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)에 붙일 레이블된 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)의 바인딩을 억제 하는 화합물을 식별 하는 검사 도구로 주로 사용 되는.

초록

G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)의 약리 타겟팅으로 많은 질병의 진행에 기여 장애 GPCR 중재 신호 인간의 건강에 매우 중요입니다. 수용 체의 ligand 쌍 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) 암 및 염증 성 질환의 치료에 대 한 잠재적인 대상으로 예를 들어 중요 한 임상 관심을 제기 하고있다. 특히 CXCR4 대상 및 수용 체의 기능을 억제 하는 치료 항 체로 서 작은 분자 약리학 유용한 도구 간주 됩니다 따라서. 여기, 흐름 cytometry 기반 셀룰러 분석 결과 CXCL12 바인딩을 CXCR4, 파기 화합물 (예를 들어, 작은 분자) 수 있도록 설명 되어 있습니다. 기본적으로, 분석 결과 붙일 레이블된 CXCL12, CXCR4, 자연 chemokine 주 작동 근의 고정 된 금액 및 레이블이 없는 화합물 사이의 바인딩 수용 체에 대 한 경쟁에 의존 합니다. 따라서, 방사성 레이블이 프로브를 사용 하 여 바람직하지이 분석 결과에 피 한다. 또한, 살아있는 세포 수용 체 (CXCR4) 세포 막 준비 대신의 원본으로 사용 됩니다. 처리량을 증가 플레이트 형식으로 분석 결과의 쉬운 적응 수 있습니다. 이 분석 결과 CXCR4 대상 화합물을 식별 하 귀중 한 제네릭 약물 발견 분석 결과 되도록 표시 되었습니다. 프로토콜 가능성이 적용할 수 있습니다 다른 GPCRs에 적어도 붙일 레이블된 ligands 사용할 수 있습니다 또는 생성 될 수 있습니다. 이러한 GPCRs의 활성화 유도 된 세포내 신호 통로 관한 사전 지식이 필요 하지 않습니다.

서문

G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)는 세포 표면 단백질 (예를 들면, 펩 티 드, 단백질 호르몬, 아민) extracellular ligands에 의해 활성화 될 수 있는, 많은 생리 적 그리고 발달을 조절 함으로써 처리¹. 한 길 항 제는 GPCR 바인딩 주머니 차지 하 고, 수용 체 단백질에 유도 구조적 변화 G_α의 구성 된 세포내 수용 체 관련 된 heterotrimeric G 단백질의 바인딩을 촉진-GDP와 G_βγ 소 단위. G_α 소 단위 결과 G 단백질 소 단위 (G_α-GTP와 G_βγ)를 차례로 추가 시작 하류의 분리에 GDP에 대 한 GTP의 후속 교환 신호 경로^2,3. G_α-GTP 분해 된다 때 다시 협회 G_α의 GDP와 G_βγ 소 단위 변환 G 단백질 다시는 휴식 상태^3,4. G 단백질의 다른 종류 (G_s, G_i/o, G_q, G_12/13), 존재는 G_α 소 단위⁵시퀀스 유사성에 따라 분류 한다. 모두 이러한 G 단백질 수용 체 활성화에 생물학 응답 기초 정의 된 세포내 신호 통로 유도. 수용 체 활성화 후 GPCR kinases (GRKs) 함으로써 β-arrestins와의 상호 작용을 촉진 하는 GPCRs의 세포내 꼬리 phosphorylate. 이 프로세스는 G 단백질 신호, 수용 체 탈 감 작과 국제화⁶의 종료에 리드. Β-arrestins는⁷을 신호 하는 G 단백질의 독립적인 폭포 트리거 신호 다 분자 복합물의 부분 있습니다.

GPCRs는 치료 적 개입에 대 한 가장 유효한 분자 표적 사이 많은의 병 인에 기여 하 고 규제 완화 GPCR 중재 신호, 예를 들면 수용 체 유전자 또는 수용 체 overexpression에 이득의 기능 돌연변이 때문으로 인간의 질병⁸. 따라서, GPCRs 제약 산업^8,,910조사 약물 목표의 가장 중요 한 클래스 중 하나를 나타냅니다. 임상 관련 GPCR의 주목할 만한 보기는 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)¹¹유일한 자연 리간드에 의해 활성화 될 수 있는 이다. 때문에 인간 면역 결핍 바이러스 1에 대 한 주요 공동 수용 체로 서의 설립된 역할 (HIV-1) 항목 및 클러스터 차별화 4의 (CD4) 긍정적인 T 세포¹², CXCR4 항 바이러스 약물 대상으로 조사에 처음에 감염. 더 골에서 CXCL12 CXCR4 상호 작용 조절 유지 그리고 줄기와 뿌리의 유도 세포¹³. 또한, 암 생물학 (예: 종양 세포 생존, 전이, 종양 관련 신생)¹⁴ 의 여러 측면에 몇 가지 다른 인간의 질병 (예를 들어, 염증 성 질환)¹⁵, CXCR4의 개입을 주어진 약물 발견에 대 한 유망 대상으로 상당한 관심을 발생합니다. AMD3100, 특히 표적으로 CXCR4, 작은 분자 항 HIV 약물 후보¹⁶ 처음 밝혀졌다 이며 여전히 가장 강력한 CXCR4 길 항 근 날짜¹⁷에 설명 중 하나. 그러나 개발으로는 항 바이러스 약물은,,¹⁸를 중단. 현재이 분자 다 발성 림프 종 환자¹⁸의 치료 중 줄기 세포 동원 에이전트로 사용 됩니다. 다른 여러 가지 화학적으로 관련이 없는 작은 분자와 다양 한 효능 가진 CXCR4 기능을 억제 하는 생물 의약품 설명된¹⁹되었습니다.

수용 체 바인딩 메서드는 관심의 GPCR와 직접 상호 작용 하는 화합물 (예를 들어, 작은 분자)의 id를 허용 하는 약리학에 귀중 한 도구입니다. 바인딩 연구를 수행 하기 위해서는 세포내 신호 속성 또는 특정된 GPCR의 기능에 관한 사전 지식에 대 한 필요가 있다. 이 이점을로 간주 될 수 있습니다, 하지만 그것은 화합물 바인딩 설명 될 수 있는 수용 체에 대 한 그들의 잠재적인 agonistic 또는 대립 활동을 평가 하 여 특징 추가 될 필요가 의미. 이 활동은 GPCR 연구에 관련 된 약리학 또는 생물학 분석 실험을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 그들의 작업 프로필에 의존, 수용 체 바인딩 분자 수 있습니다 다음 잠재적으로 진화 될 전 임상 및 임상 연구에 조사에 대 한 소설 리드 화합물. 예를 들어 종양 세포²⁰, 비 침 투 적인 vivo에서 이미징 radiolabeling 여 치료 또는 진단 도구를 생성 하는 건설 기계 또는 잠재력으로 특히 높은 선호도와 수용 체에 묶는 분자도 사용할 수 있습니다. 치료제²¹의 대상 배달 차량. CXCR4, 경우 종양 세포의 이미징 vivo에서 이미 입증 되었습니다 레이블이 CXCR4 타겟팅 분자 인간 암 xenografts^{20,22,23의 시각화를 허용 하는 어떤 점에서 마우스 모델을 사용 하 여} .

이 보고서에서 우리는 작은 분자와 방해 하는 직접 길 항 제 (CXCL12) 바인딩 CXCR4 biologics의 식별을 가능 하 게 경쟁 바인딩 분석 결과 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과의 기본 원리는 붙일 레이블된 ligand의 고정 된 금액 간의 경쟁 (CXCL12^AF647, 참조 테이블의 재료 및 시 약)과 화합물 바인딩 수용 체 단백질^17, 에 대 한 레이블 없음 ²⁴. 레이블이 ligand CXCR4 표현 하는 단일 셀에 바인딩된에서 특정 형광 신호 다음 cytometry에 의해 분석 됩니다. 이 형광 신호 레이블 없는 작은 분자 CXCL12^AF647 와 CXCR4 간의 상호 작용을 방해 하는 경우에 줄어들 것입니다. 분석 결과 endogenously 익스프레스 CXCR4 조작 아닌 살아있는 세포를 사용 하 여 (즉, Jurkat 세포). 따라서, 아무 세포 막 준비는 필요 하 게 분석 결과 편리, 신속 하 고 늘어난된 처리량과 호환. 붙일 레이블된 ligand 사용 되므로 방사능은 피 한다.

분석 결과에서 CXCL12^AF647 바인딩을 방해 하는 작은 분자 화합물 (즉, 바인딩 사이트는 자연에 의해 점령 orthosteric 수용 체 바인딩 사이트와 상호 작용을 확률이 CXCL12 CXCR4 위한 자연 길 항 제 이므로 주 작동 근)입니다. 그들은 CXCL12의 바인딩을 좌우 하지 않는다 것 세 orthosteric 바인딩 사이트에서 고유 수용 체 바인딩 사이트와 상호 작용 하는 분자 들 키 지 않고, 남아 있습니다. 예를 들어, 긍정적이 고 부정적인 allosteric 변조기, 분자 allosteric 바인딩 사이트²⁵에 행동을 타겟팅 하는 GPCR의 중요 하 고 신흥 카테고리 것입니다 잠재적으로 하지 주워이 분석 결과 함께. 또한, 수용 체 길 항 제 또는 촉진제로는 화합물이 바인딩 분석 기능으로 식별 여부를 파생 수 없습니다. 추가적인 약리 또는 기능 수용 체 관련 분석 실험에서 확인 된 화합물의 조사 따라서 하셔야 합니다. 이 분석 실험의 (조합) 포함 될 수 있습니다 두 번째 메신저 (예를 들어, 캘리포니아^{2 +}, 순환 아데노신 monophosphate (캠프)), phenotypic의 검출에 대 한 분석 실험 세포 형광 또는 발광 기반 또는 생물학 분석 실험 및 β-arrestin GPCR 연구의 특정 신호 속성에 따라 어떤 선택 채용 분석 실험 따라서, 주로 여기에 설명 된 경쟁 바인딩 분석 결과 초기 심사 분석 결과 수용 체 바인딩 힘으로 화합물의 깊이 특성을 사용 하도록 다른 세포 기반 분석으로 보완 하는 역할을 합니다.

프로토콜

1입니다. 세포 배양의 유지 보수

참고: 1과 2에 설명 된 모든 단계는 층 류 캐비닛에 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.

1. 37 ° C, 5% CO₂ 습도 인큐베이터 T75 문화 플라스 크에 세포 성장.
   참고:이 분석 결과에서 Jurkat 세포 (즉, 인간의 leukemic T 림프 구 세포 endogenously CXCR4¹⁷익스프레스)는 사용 됩니다. 세포 표면에 CXCR4 표현의 cytometry에 의하여 세포 배양을 통해 평가 되어야 한다. 그러나 교류 cytometry 절차 및 셀 표면에 수용 체 식 수준 아니다,,이 프로토콜의 범위 내에서 하지만 되었습니다 확인 시 약의 설명 설명 이전¹⁷.
2. 하자 Jurkat 세포 성장에 80-85%에 도달할 때까지 confluency. 소설 플라스 크에 세포를 뿌리고, 하기 전에 실내 온도 (RT)를 도달 하는 모든 시 약을 하실 수 있습니다.
3. 소설 T75 문화 플라스 크를 신선한 완전 한 성장 매체 (RPMI-1640 매체, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2mm 글루타민) 20 mL를 추가 합니다.
4. 소설 T75 문화 플라스 크를 (세포 현 탁 액 25 mL를 포함 하는) 원래 T75 플라스 크에서 Jurkat 세포 현 탁 액 5 mL를 추가 합니다. 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 품 어.

2. 경쟁 분석 결과 바인딩 CXCL12, 분석 결과 버퍼 및 Jurkat 세포의 준비.

1. 동결 건조 된 시 약 (어둠 속에서-80 ° C에 저장) 초순 0.01% (볼륨/볼륨) 폴 20의 보충에 용 해 하 여 CXCL12^AF647 (20 µ g/mL, 참조 테이블의 재료 및 시 약)의 재고 솔루션을 준비 합니다. 단일 저장소-80 ° c, 빛 으로부터 보호이 재고 솔루션에서 aliquots를 사용 합니다.
2. 200 mL 행 크의 균형 소금물 (HBSS, 10 배, 페 놀 레드과 나트륨 중 탄산염, 최종 농도 x 1 없이) 40 mL HEPES (1 M, 20mm 최종 농도)를 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 추가 초순 2 L. 추가 4 g (0.2% 무게/볼륨) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 최종 볼륨을 가져오고 자기 통해 BSA를 분해 하는 감동. 마지막으로, pH 7.4 (NaOH을 사용 하 여이 대 한)를 조정 하 고 참조 테이블의 재료 및 시 약0.2 µ m 숨 구멍을 통해 솔루션 필터 진공 매니폴드를 사용 하 여.
   참고:이 분석 결과 버퍼 프로토콜의 모든 추가 단계에 사용 됩니다.
3. 수와 세포의 생존 능력을 계산 합니다. 이 위해, 세포 현 탁 액의 샘플 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 희석.
   참고: 우리 정기적으로 사용 하 여 자동된 세포 생존 능력 분석 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 다양 한 농도에서 세포 정지 계산의 능력. 셀 계산에 대 한 세포 현 탁 액 1.5 ml PBS (다른 희석, 예를 들어, 1.9 ml PBS, 0.1 mL 있습니다 가능) 0.5 mL를 희석. Trypan blue 염료 제외 방법에 근거 하는이 메서드의 사용 되었습니다²⁶위에서 설명한. 다른 여러 장치 계산 셀 번호와 동일 하 게 작동 하는 생존에 대 한 상업적으로 사용할 수 있습니다.
4. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 (사용 하는 원심 분리기의 종류에 대 한 재료 및 시 약의 표 참조)에 의해 살 균 50 mL 튜브에 셀 (즉, ~ 24 x 10⁶ 셀 하나의 완전 한 96 잘 접시와 분석 결과 실행)의 원하는 번호를 수집 실시간
5. 부드럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 붓는 다. 신선한 분석 결과 버퍼를 추가 (예: 20 mL)와 부드럽게 위아래로 pipetting으로 셀 resuspend.
6. 실시간에서 5 분에 대 한 400 x g에서 다시 셀을 원심
7. 상쾌한 떨어져 다시와 5 x 10⁶ 셀/mL의 조밀도를 신선한 분석 결과 버퍼에서 셀 펠 릿 resuspend.

3. 경쟁 의무적인 분석 실험

참고: 실제 경쟁 바인딩 분석 결과 RT에서 수행 되 고 비 살 균 조건 하에서 수행할 수 있습니다.

1. 조사 분석 결과 버퍼에서 화합물을 희석 (2.2 참조) 원하는 농도를. 자세한 화합물의 특성에 대 한 초기 심사 (예를 들어, 10 µ M 최종 농도)에 대 한 화합물의 농도 고정된 하거나, 또는 농도의 직렬 희석 시리즈 준비 중 (예를 들어, 1/3, 1/4 또는 1 / 5 희석 시리즈 1 µ M, 최종 농도에서 시작). 복합 솔루션 궁극적으로 2 x 분석 결과;에 희석 될 다는 것을 명심합니다 따라서, 집중된 솔루션 x 2를 준비 합니다.
2. 바닥판 라운드 분명 96-잘으로 복합 솔루션 (2 배 농축) 100 µ L를 분배 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 밖으로 (예를 들어, 그림 1C) 미리 정의 된 실험 배치에 따르면.
   참고:이 단계에서 부정과 긍정적인 제어 샘플 분석 결과에 포함 됩니다. 부정적인 컨트롤 샘플분석 결과 버퍼의 100 µ L 96 잘 접시의 우물에 화합물 대신 추가 됩니다. 긍정적인 컨트롤 샘플에 대 한 분석 결과 버퍼는이 단계에 추가 됩니다. 또한 여러 가지 화합물의 희석 시리즈 테스트는 일반적인 실험 레이아웃에 대 한 그림 1C 참조.
3. 세포 현 탁 액의 50 µ L 추가 (2.7; 참조 10⁶ 셀 x 0.25) 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시에 시 약 저수지에서. 어둠 속에서 RT에서 15 분 동안 접시를 품 어.
4. 붙일 레이블된 CXCL12의 50 µ L 추가 (CXCL12^AF647 분석 결과 버퍼, 집중 하는 4 x 25 ng/mL의 최종 농도에즉, 100 ng/mL) 96 잘 접시의 우물에 비슷한 시 저수지에서. 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어.
   주: 부정적인 컨트롤 샘플에 대 한 추가 분석 결과 버퍼 대신 합니다. 따라서, 부정적인 컨트롤 샘플에서 검출 하는 형광 신호 autofluorescent 배경 신호 (그림 1A)에 대응 됩니다. 긍정적인 통제 견본CXCL12^AF647의 50 µ L/잘 추가 합니다. 긍정적인 통제 견본 최대한 형광 신호 감지, 이후 아무 잠재적인 억제 화합물과 사전 외피에 의해 포함 되었다 (그림 1A)를 얻을 것입니다.
5. 접시를 뒤집어 여 실시간 제거 수송과 세포에서 상쾌한에 5 분에 대 한 400 x g에서 96 잘 접시를 원심. 조직에 접시를 건조.
6. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 우물을 시 저수지에서 신선한 분석 결과 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 바로 진행 합니다.
7. 접시를 뒤집어 여 실시간 제거는 상쾌한에 x 400g에 5 분 동안 다시 접시를 원심 하 고 조직에 다시 그것을 건조.
8. 부드럽게 1% paraformaldehyde PBS에 용 해의 200 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend. 이 단계는 셀 해결 됩니다.
9. Cytometry 여 형광의 정량화와 즉시 프로토콜을 계속 합니다.

4. cytometry에 의해 샘플의 분석

CXCL12^AF647 얼룩이 고 집착된 셀 cytometry 사용 하 여 분석할 준비가 됩니다. 교류 cytometers의 여러 종류를 사용할 수 있습니다, 하지만 그들은 정확한 레이저 (즉, 빨간색 레이저, 여기 범위 ~ 630 nm) 여기와 fluorophore 탐지에 대 한 적합 한 필터 장착 해야 (방출 필터 ~ 660 nm). 그들은 96 잘 접시 형태로 샘플을 처리할 수 있이 필요가 있다. 적당 한 흐름 cytometry 장치의 예는 테이블의 재료 및 시 약에부여 됩니다.

1. 장치를 시작 하 고 해당 소프트웨어를 열고 ( 테이블의 재료 및 시 약참조).
2. 점 오 점 형식으로 시각을 다음 세포 매개 변수 선택: 산포 (FSC), 측면 살포 (SSC) 및 fluorophore (CXCL12^AF647) 검색 채널 전달.
   참고: FSC 매개 변수를 사용 하는 세포는 차별 그들의 크기에 따라 감지 된 빛 흡수 셀의 직경에 비례 이기 때문. SSC 매개 변수를 90 ° 각도로 산란 측정 셀의 세분성에 대 한 정보를 제공 합니다.
3. FSC 그리고 SSC 매개 변수를 기반으로 정의 된 동질적인 셀 인구의 게이팅을 수행 하려면 하나의 샘플 (예를 들어, 부정적인 컨트롤 샘플)을 선택 합니다.
   1. 교류 cytometer에 집착 셀 ~ 100 µ L의 자동 주입이 부정적인 컨트롤 샘플에서 선택 합니다. 옵션 "혼합" 주입 하기 전에 선택한 1.5 µ L/s의 샘플 유량을 사용 합니다.
   2. "취득 데이터."를 선택 하 여이 샘플을 실행 이 샘플에 대 한 FSC 그리고 SSC 매개 변수는 화면에 표시 됩니다.
   3. 소프트웨어의 제어 도구를 선택 합니다. 미리 FSC 그리고 SSC 점 오 점 시각에 따라 달라 집니다, 게이팅 하 여 균일 하 고 가능한 세포 인구를 정의 합니다. 이렇게 하려면 homogenously 분산된 단일 셀 (이 하 "행사")이 두 차원에 따라 포함 (를 사용 하 여 소프트웨어의 제어 도구) 다각형을 만듭니다.
      참고: 제어 절차는 추가 분석을 위해 사용 될 것 이다 균질이 고 실행 가능한 세포 인구를 정의 하는 것을 목표로. 게이팅 가능한 세포의 대다수 FSC 그리고 SSC 매개 변수에 따라 동종 세포 인구를 형성할 것 이다 가정에 의존 합니다. 이 단계를 수행 하 여 세포질 파편, 죽은 세포, 및 셀 집계 수 주로에서 제외 추가 분석. 제어 프로세스의 그림은 그림 1B에서 제공 됩니다.
4. 20000 "" (즉, 단일 셀) 당 이벤트 샘플 분석을 선택 합니다.
   참고:이 각 샘플에 대 한 미리 정의 된 게이트 내에 있는 20000 셀 결국 분석 될 것 이다 의미 합니다. 각 샘플에 대 한 데이터 수집 이벤트의이 수 분석 될 때까지 계속 됩니다.
5. 실행 (선택 "레코드 데이터")를 시작 합니다. 교류 cytometry 장치 각 샘플에 대 한 평균 형광 강도 (MFI)을 기록 하 여 지금 모든 샘플 하나 하나를 분석 합니다. 이 MFI 의미 형광 신호에 해당 하는 미리 정의 된 게이트 내에 있는 20000 셀에 해당 합니다.

5. 데이터 분석

각 샘플에 대 한 얻은 MFI를 사용 하 여 모든 추가 계산을 수행 하. 교류 cytometry 데이터의 분석 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 여러 상용 소프트웨어 패키지에서 수행할 수 있습니다.

1. 복합 사전 인큐베이션 결과로 형광 바인딩 신호의 비율 억제를 결정 하려면 다음 수식을 적용.
   
   장소:
   MFI_특급 (= 화합물 취급) 실험의 MFI = 샘플
   MFI_PC 긍정적인 통제의 MFI를 =
   MFI_NC 부정적인 컨트롤의 MFI를 =
2. (즉, 50%에 의해 형광 바인딩 신호를 줄일 수 있는 화합물의 농도) 화합물의 IC₅₀ 값을 확인 하려면 다음 수식을 적용:
   
   장소:
   로그_conc.2 = 50% 미만에서 발생 하는 화합물의 농도의 로그 PC와 NC의 MFI 값의 차이의 저해
   로그_conc.1 = 50% 이상에서 발생 하는 화합물의 농도의 로그 PC와 NC의 MFI 값의 차이의 저해
   참고: 또는, 높은 활성 화합물의 경우 규모의 여러 로그를 다루는 복용량 응답 곡선 생성할 수 있습니다 화합물의 각 시험된 농도에 해당 MFI에 기반. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 비선형 회귀 곡선 맞춤을 적용 하 여 (참조 테이블의 재료 및 시 약), IC₅₀ 값 다음 생성 된 커브에서 연 역 될 수 있습니다. 이 분석 방법의 예는 그림 3에 표시 됩니다.

결과

바인딩 분석 결과의 일반적인 워크플로 그림 1A에 제공 됩니다. 다른 샘플 형식 (즉, 부정적인 컨트롤, 긍정적인 제어 및 실험 샘플) 표준 실험에 대 한 얻은 흐름 cytometry 데이터 유형의 그림은 묘사 그림 1B을 가능한 접시 레이아웃을 수행 하 96 잘 접시 형태로 분석 결과 그림 1C에서 주어진 다. Endogeno...

토론

바인딩 분석 (즉, 채도 바인딩 및 바인딩 운동 실험)의 다른 유형에 비해, 경쟁 의무적인 분석 실험은 심사 목적에 가장 적합. 실제로, 그들은 레이블이 지정 된 수용 체 ligand의 고정 된 금액의 바인딩을 방해 하는 그들의 기능을 채 점 하 여 레이블이 없는 화합물, 예를 들어 작은 분자의 큰 배치의 평가 허용. 레이블이 리간드 보다 다른 수용 체 사이트에 바인딩되는 화합물 분석 결과에 들 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II	Becton Dickinson	Not applicable	Flow cytometry device
BD FACSDIVA Software
BD FACSArray	Becton Dickinson	Not applicable	Flow cytometry device
BD FACSArray System Software
Graphpad Prism	Graphpad		software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3
FlowJo	FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.
Vi-CELL	Beckman Coulter	Not applicable	cell viability analyzer
Sigma 3-18 KS	Sigma	Not applicable	centrifuge
AMD3100	Sigma	A5602-5mg	specific CXCR4 antagonist
Maraviroc	Pfizer		antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647)	ALMAC	CAF-11-B-01	fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco (Life Technologies)	10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1933-25G
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES (1M)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Jurkat cells	ATCC
Reagent reservoir PP	Sigma	BR703411
Rapid flow filter: 0.2 µm aPES	Thermo Scientific	566-0020
Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear	Thermo Scientific	611U96
Falcon tubes, 50ml	Greiner Bio-One	227 261
Tissue culture flask (T75)	Corning	353024