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要約

全血ベースのイムノアッセイは、診断および研究目的で抗原特異的免疫を分析するための簡単でリソース効率の高いツールを提供します。この記事では、真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の包括的な分析のための、二重共刺激による最適化された全血ベースのプロトコルを提供します。これには、小児患者および小動物向けの少量バージョンが含まれます。

要約

迅速でリソース効率の高いサンプル処理、ハイスループット、および高い堅牢性は、高度な抗原特異的イムノアッセイの効果的な科学的および臨床的応用にとって重要です。従来、このようなイムノアッセイ、特にフローサイトメトリーや酵素結合免疫吸着スポットアッセイによる抗原特異的T細胞分析は、末梢血単核細胞の単離に頼ることが多いと考えられていました。このプロセスは時間がかかり、多くの分析前の交絡因子の影響を受けやすく、大量の血液を必要とします。全血ベースのアッセイは、分析前の堅牢性を高め、必要な血液量を減らすための簡単な代替手段を提供します。さらに、全血ベースのアッセイでは、単離された細胞サブセットを用いたアッセイでは捕捉されない細胞間相互作用の保存が可能になります。最近、抗原特異的T細胞機能とさまざまな真菌およびウイルス抗原に応答した複雑な細胞間相互作用の両方を包括的に分析するための、二重の抗CD28および抗CD49d共刺激を用いた洗練された全血免疫測定法が提案されています。このプロトコルは、刺激チューブの調製、血液刺激、およびフローサイトメトリー、サイトカイン分泌アッセイ、および転写分析のための下流のサンプル処理に関するガイダンスを提供します。これには、検証済みで機能的に同等で、これまで発表されていない低容量のプロトコル(250 μL)が含まれており、小児患者を対象とした研究や小動物(マウスなど)での研究において、フローサイトメトリーおよびサイトカインベースのT細胞モニタリングをより利用しやすくします。全体として、これらのプロトコルは、臨床研究とトランスレーショナル研究の両方の環境で複雑な抗原特異的免疫分析のための汎用性の高いツールボックスを提供します。

概要

抗原特異的免疫、特に特異的T細胞応答の定量化と特性評価は、免疫生物学やワクチン接種研究、および一部の診断検査にとって極めて重要です。従来、抗原特異的イムノアッセイは、単離された末梢血単核細胞(PBMC)に依存するのが一般的でした。しかし、これらの細胞の単離には時間と資源が大量にかかり、多くの場合、比較的大量の血液が必要です。さらに、分析前保管中の顆粒球の活性化とそれに続くT細胞の乱れを防ぐためには、サンプルの迅速な処理が最も重要ですが、これは臨床現場では実現できないことがよくあります。これらの制限は、ハイスループット研究のシナリオや臨床ルーチンにおける抗原特異的イムノアッセイの実用性を妨げます。そのため、近年、使いやすく自動化可能な全血ベースのアプローチの開発により、イムノアッセイアプリケーションの新しい領域が開かれています。しかし、現在市販されているシステムは通常、T細胞にとって最適な共刺激環境を欠いており、分析前の遅延の影響を受けやすいです。例えば、広く使用されている全血ベースのIFN-γ放出アッセイは、分析前の血液保存の6時間後に19%の陽性から陰性の復帰率を示しています2。これらの制限を克服するために、二重の抗CD28および抗CD49d共刺激による最適化されたプロトコルが開発された3,4,5,6。

ここで紹介するプロトコールは、抗原特異的T細胞の正確で再現性のある定量と特性評価、抗原誘発性サイトカイン応答の評価、およびその他の(フローサイトメトリーまたは転写)機能免疫マーカーを最小限の血液量、すなわち刺激チューブあたり500μLから可能にします。このプロトコルのさらなる利点には、ハンズオン時間が短いこと、分析前の交絡因子に対する高い回復力、および比較的生理学的な ex vivo 環境での機能的な細胞間相互作用の保存が含まれます。全血フローサイトメトリー抗原特異的T細胞の特性評価と、従来のPBMCベースのアッセイから生成されたデータの比較可能性は、以前にカビ特異的T細胞定量の文脈で示されています6。さらに、被験者の血液を直接刺激することで、最適なPBMC刺激に一般的に必要とされる自家血清、同種血清、さらには異種血清の補給の必要性がなくなります。また、細胞単離を省略することで、せん断ストレスや温度ストレスが軽減され、細胞の生存率が向上します。最も重要なことは、全血ベースのアッセイは、PBMCの単離のための勾配遠心分離中に失われた顆粒球集団を保存することです7。これにより、このアッセイセットアップは、顆粒球と単核細胞との間の機能的相互作用ループを保存および捕捉します4。

注目すべきは、このプロトコルは、異なる読み出しモダリティに対応するために最小限の変更しか必要とせず、同じ刺激チューブからのサイトカイン放出と転写応答の二重分析さえ可能にすることです。具体的には、刺激後に培養上清からサイトカインを解析する一方で、細胞ペレットをRNA単離に用い、その後のトランスクリプトーム解析に用いることができます。さまざまな読み出しモダリティの一般的なワークフローを 図 1 にまとめます。

近年、研究や臨床現場での病原体反応性免疫モニタリングのために、結核菌8,9、百日咳菌3、Orientia tsutsugamushi10、SARS-CoV-2 5,11,12など、全血ベースのアッセイが開発されています。例えば、以前に確立されたシステムは、結核菌、インフルエンザAウイルス、およびSARS-CoV-2を含む複数の抗原に使用されてきたが、Tヘルパー(Th)細胞刺激13,14,15に最適化された共刺激因子を使用していない。これらのアッセイに必要な血液量は、従来のPBMCベースのアッセイや市販の全血刺激キットに使用される血液量よりもすでに大幅に少なくなっていますが、小児科、新生児科、集中治療室(ICU)の患者、および小動物モデルでの前臨床研究への応用には、さらに少ないサンプル量が保証される可能性があります。例えば、マウスからの終末採血(心臓穿刺など)でも、一般的に最大0.7〜1mLの血液が得られます。したがって、刺激チューブあたり250μLの血液量からの抗原反応性T細胞応答の正確な定量化および特性評価のために、以前に確立された全血ベースの免疫測定プロトコル4,6をさらにダウンスケールする可能性が、このプロトコルの一部として評価されています。

プロトコル

ルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘンの倫理委員会(プロジェクト番号21-0689)は、ヒトの血液サンプルの収集を承認しました。さらに、代表的なデータセットの一部は、ルートヴィヒ・マクシミリアン大学ミュンヘンの倫理委員会によって承認されたCorona-Register-Study番号20-426で生成されました。インフォームドコンセントが得られました。

1. 全血刺激チューブの作製

注:このステップは、Lauruschkat et al.4 およびWeis et al.6から引用しています。 表1 に、詳細な試薬濃度と試薬容量をまとめています。

  1. 無菌条件下で(滅菌作業台)、抗原と共刺激抗体を含む、抗凝固剤を含まない2.7mLの採血管を準備します。1 μg/mL の α-CD28 と 1 μg/mL の α-CD49d を、ネガティブコントロールを含めて各チューブに加えます。最終濃度(250μLまたは500μL)を決定する際には、全血刺激のために加える血液量を考慮してください。チャンバーの形状とサンプルのアクセス性を維持するために、プランジャーを採血管から引っ込めないでください。
  2. 研究デザインに基づいて、ネガティブコントロールチューブに追加の刺激を含まないか( 表1に示すように、刺激を受けていないバックグラウンドコントロール)、または研究コホートが抗原特異的T細胞をまったくまたは最小限に保持するべき抗原(例えば、HIV血清陰性の個人のHIVペプチドプール)を使用するかを決定します 16。
  3. 抗原特異的な刺激については、予備実験で滴定することにより、抗原の理想的な濃度を最適化します。以下の代表的なデータを生成するには、最適化された抗原濃度 1.2 μg/mL HSV-1 ライセート、0.6 nM/ペプチド/mL CMV pp65、0.6 nM/ペプチド/mL SARS-CoV-2 Prot_S、50 μg/mL Aspergillus fumigatus ライセート、および 1 ng/mL CRX-527 を使用します。
  4. 特にリンパ球減少症の患者や免疫抑制薬療法を受けている患者を対象とした研究には、ポジティブコントロールを含めます。サイトメガロウイルス、パラインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルスペプチドからなるCPIポジティブコントロール溶液(0.6 nM/peptide/mL)を使用してください。
    注:あるいは、PMA(10μg/mL)±イオノマイシン(1μg/mL)などの合成刺激を使用することもできますが、生理学的反応の誘導が少なく、フローサイトメトリーの集団マーカーとして一般的に使用される表面抗原(最も顕著なのはCD417)の発現に影響を与える可能性があります。共刺激抗体は、ほとんどの合成ポジティブコントロール刺激と併用する必要はなく、細胞の生存率と応答性に悪影響を与える可能性があることに注意してください。
  5. すべての刺激チューブで試薬量を調和させるには、RPMI 1640培地を以下の総容量まで追加します: フローサイトメトリーのフルスケールアッセイ:50 μL;サイトカイン解析およびトランスクリプトミクスのためのフルスケールアッセイ:500 μL;フローサイトメトリーの小規模アッセイ:25 μL;サイトカイン解析およびトランスクリプトミクス用の小規模アッセイ:250 μL。
    注:複数の刺激チューブのセットを調製する場合は、汚染のリスクが低く、共刺激因子と刺激の量が少ないため、すべての成分を含むマスターミックスを調製することをお勧めします。
  6. 準備したチューブはすぐに使用するか、-20°Cで凍結保存します。 ほとんどの試薬は最大4週間保存できます。ただし、新しい試薬/刺激の最大保存期間を事前に検証してください。

2. 全血サンプルの刺激とインキュベーション

  1. 全血刺激の約30〜60分前に、すぐに使用できる刺激チューブを解凍し、室温に保ちます。
  2. ヘパリン抗凝固リチウムを含む採血チューブを使用して、ドナー/患者から静脈血を採取します。採取した血液量が個々の実験要件を満たしていること、すなわち、ネガティブコントロールとポジティブコントロールを含む小規模アッセイの3つの条件に最低750μLが必要であることを確認します。市販の採血管の場合、ヘパリン使用濃度が16〜25 IU/mLの血液になるように、チューブを完全に充填します。
    注:代表的なデータセットを生成するために募集された健康な成人被験者の人口統計データを 表2に示します。
  3. 必要な量のヘパリン処理全血(小規模アッセイでは250 μLまたはフルスケールアッセイで500 μL)を、滅菌ワークベンチの下でピペッティングして刺激チューブに移します。
    注:滅菌ワークベンチが利用できない場合、または感染のリスクが最小限のサンプル(つまり、事前にスクリーニングされたヒト被験者または動物の血液)を扱う場合は、滅菌シリンジを使用してサンプルを刺激チューブに移すことができます。また、この方法により、採血直後のベッドサイドでのサンプル処理が可能となり、分析前の保存やT細胞の障害を最小限に抑えることができます。血液を注入する前に、採血チューブとすべての刺激チューブの両方のゴム製シールをアルコール消毒剤で広範囲に消毒します。.消毒液を少なくとも1分間乾かします。
  4. 刺激チューブを5x〜10x慎重に反転させます。37°Cのインキュベーターに刺激チューブを入れます。CO2 インキュベーターは不要です。非特異的な好中球の活性化を防ぐため、採血管を冷蔵しないでください。
    注:このプロトコルは、サンプルの輸送を可能にするために、室温で最大8時間の分析前血液保存について検証されています。可能であれば、共刺激因子がリンパ球の生存率を改善するため、収集部位の刺激チューブに全血を注入し、刺激チューブで血液を中央実験室に輸送することが好ましい18,19。
  5. 細胞内染色を伴うフローサイトメトリーアッセイに使用するサンプルのみ、インキュベーションの4時間後に各刺激チューブにブレフェルジンA(最終濃度10 μg/mL)を添加します。
    1. RPMIで1 mg/mLのブレフェルジンA溶液を調製し、サンプル容量100 μLあたり1 μLの溶液を加えます(つまり、プレミックス刺激カクテル+全血量)。チューブのキャップを外し、滅菌作業台の下でピペッティングして、ブレフェルジンAを添加します。チューブをキャップし、37°Cインキュベーターに戻し、37°Cでさらに16〜18時間(合計20〜22時間)戻します。
  6. サイトカイン分泌アッセイまたは転写解析では、ブレフェルジンAを添加せず、サンプルを37°Cで24〜26時間連続的にインキュベートします。
    注:ブレフェルジンAはゴルジ体を阻害し、それによりサイトカイン分泌と細胞表面へのタンパク質の輸送を無効化します。分泌または表面発現は、それぞれ再内在化後に最終的にタンパク質の損失と分解をもたらすため、エキソサイトーシス阻害剤は、サイトカインの細胞内蓄積と染色に不可欠であり、フローサイトメトリー研究のための一部の活性化マーカー(CD154など)にも不可欠です。しかし、ブレフェルジンAは、トランスクリプトームに見える生理学的細胞プロセスをも妨害し、培養上清からのサイトカイン分泌アッセイを無効にします20,21、これらの読み出しを並行して行うためには、2つの別々の試験管(1つはブレフェルジンAの有無)を使用する必要があります。

3. フローサイトメトリー用サンプルの調製

  1. 各刺激チューブに500 μLの0.5 M EDTA溶液を加え、サンプルを室温で15分間インキュベートして、チューブの表面から付着細胞を剥離します。
  2. サンプルを新しい15 mL遠心分離チューブに移します。刺激チューブを1 mLの赤血球溶解バッファーですすぎ、残りの血液細胞を採取し、バッファーと細胞を同じ15 mL遠心チューブに加えます。
  3. 15 mLチューブを600 x gで7分間遠心分離します。上清は慎重に捨てます。
  4. 血球ペレットを赤血球溶解バッファーに再懸濁します(図2A)。全血500 μLには赤血球溶解バッファー5 mLを、全血250 μLには3 mLを使用します。
    注:最適な赤血球溶解条件は、使用する特定のバッファー(自社または市販製品)に対して事前に評価する必要があります。ここで説明する手順は、材料の表に記載されている赤血球溶解バッファーに最適化されています。
  5. サンプルが透明になるまで、室温でサンプルをインキュベートします(図2B)。顆粒球の溶解と凝集を防ぐために、6分を超えるインキュベーションをしないでください。赤血球溶解が成功したことを示す指標は、液体を通して15 mLチューブの数値とスケールを見る能力です(図2C)。
  6. 15 mLチューブを600 x gで7分間遠心分離します。上清を慎重に捨て、細胞ペレットがまだ著しく赤い場合は手順3.4〜3.5を繰り返します。
  7. 細胞ペレットを1 mLのHBSSに再懸濁し、細胞を2 mLの反応チューブに移します。
  8. 2 mLチューブを400 x gで5分間遠心分離します。上清は慎重に捨てます。
  9. フローサイトメトリー染色は、使用する細胞内染色キットおよび抗体の製造元の指示に従って行ってください。
    注:代表的なデータセットの生成に使用した抗体パネルを表3にまとめます。

4. サイトカインアッセイ用サンプルの調製

  1. ステップ2.6の後、希釈した血液を刺激チューブから1.5mLチューブに移します。
  2. 1.5 mLチューブを2000 x gで20分間遠心分離します。上清を新鮮な1.5 mLチューブに慎重にピペットで移し、すぐにサイトカイン分析に使用するか、上清を-80°Cで凍結保存します。
  3. 上清を≥ 7000 x g (1.5 mLチューブ内)で5分間遠心分離し、分析前、特に融解後に残留細胞破片を除去します。サイトカインアッセイのプロトコルに応じて、サンプルの事前希釈を行います。
  4. 細胞ペレットを1 mLのRNA保護バッファーに再懸濁し、その後のRNA単離のために-80°Cで凍結保存します。あるいは、RNA単離キット(または社内プロトコール)の指示に従って、細胞ペレットを溶解バッファーに再懸濁し、直ちにRNAを単離します。
    注:必要に応じて、後続のRNAプロセシングプロトコルに応じて、RNA保護バッファーを添加する前に、3.4〜3.5と同様の赤血球溶解ステップを追加することができます。

結果

病原体関連抗原による全血刺激後の抗原特異的免疫応答のマルチモーダル解析
代表的なデータセットを生成するために、SARS-CoV-2ワクチン接種を受けたHSV-1およびCMVに対して血清陽性の健康な成人ドナーを選択しました。単純ヘルペスウイルス1(HSV)ライセート(メーカー推奨、未発表データ)、サイトメガロウイルス(CMV)pp6522、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)5,23 Prot_S 5,23、Aspergillus fumigatus lysate(遍在する環境病原体)4,24、CRX-527(リポ多糖に基づくToll様受容体4刺激で、それ自体はT細胞を活性化しないはず)25、およびCPI(CMV、パラインフルエンザウイルス、およびインフルエンザウイルスペプチドからなるCD4+ T細胞活性化のポジティブコントロール)26。フローサイトメトリーデータとゲーティング戦略を図3に示します。一般に、希少な細胞集団(50,000〜100,000のリンパ球)を標的とする場合、測定の精度と信頼性はイベント27の総数に依存するため、できるだけ多くのリンパ球を測定することが推奨される。刺激を受けていないサンプルは、個々の細胞サブセット(CD3+CD4+細胞など)のゲーティングに使用されます。メモリーT細胞表現型解析のためのCD45ROおよびCCR7のゲートは、CD3+CD4+の全集団に設定した後、活性化マーカー陽性集団に移すべきである。個々のゲートについて、例えばリンパ球生存率の違いを考慮するために、わずかな調整が必要な場合がある。CD154(またはCD40リガンド)のアップレギュレーションは、全体的で一貫性があり、迅速に誘導されるTヘルパー細胞活性化マーカーとして記載されている28,29。IFN-γは、最も顕著な1型特異的T細胞活性化マーカーの1つと考えられている30,31。重要なことに、このアッセイは、さまざまな追加の活性化、消耗、およびサイトカインマーカーとともにテストされ、発表されています(表4および24を参照)。

刺激を受けていないサンプルの活性化マーカー陽性集団の頻度は、非特異的な背景を表し、抗原刺激頻度から差し引かれました。非特異的バックグラウンドを差し引いた後、代表ドナーはそれぞれ0.75%(HSV)、0.09%(CMV)、0.06%(SARS-CoV-2)、0.34%(A.fumigatus)、0.00%(CRX-527)、および1.21%(CPI)の特異的CD154+/CD3+CD4+ TヘルパーT細胞を有しました。IFN-γの発現も同様に解析でき、0.12%(HSV)、0.07%(CMV)、0.03%(SARS-CoV-2)、0.04%(A.fumigatus)、0%(CRX-527)、および0.74%(CPI)のIFN-γ+/CD3+CD4+細胞 が得られます。

T細胞集団は、ナイーブT細胞(TN、CD45RO−CCR7+)、セントラルメモリーT細胞(TCM、CD45RO+CCR7+)、エフェクターメモリーT細胞(TEM、CD45RO+CCR7−)、およびエフェクターT細胞(およびCD45RA、TE/TEMRA、CD45RO−CCR7−を再発現するエフェクターメモリーT細胞)にさらに細分化することができる。全体的なCD3+CD4+ T細胞のうち、代表ドナーは、非刺激サンプルを用いて測定したところ、それぞれ38.34%のTN、38.33%のTCM、20.77%のTEM、および2.56%のTE/TEMRAを有していました(図3A)。しかし、抗原特異的反応性ヘルパーT細胞(CD154+IFN-γ+)の中では、TCM とTEM が圧倒的に多く、それぞれ22.14%と73.97%でした。

追加の白血球集団に関するデータは、この方法論を用いて以前に発表されている24。使用した抗体の組み合わせを、さらなる参考のために 表4 に示します。

さらに、この方法論の可能性を最大限に引き出すために、刺激されたサンプルの2番目のセットに対してIFN-γ ELISAが実行されました(ブレフェルジンAを添加せずに)。IFN-γ ELISA キットの検出範囲を超えないように、CPI 刺激サンプルからの血漿を 1:4 にあらかじめ希釈しました。次のIFN-γ濃度を測定し、被験者の血液量の mL あたりで正規化しました。つまり、刺激チューブと ELISA 前の希釈の両方で希釈を補正しました: 0 pg/mL (非刺激)、69.4 pg/mL (HSV)、471 pg/mL (CMV)、17.8 pg/mL (SARS-CoV-2)、61.9 pg/mL (A. fumigatus)、34.0 pg/mL (CRX-527)、および 1958 pg/mL (CPI)。

最後に、同じサンプルからRNAを単離し、一貫した結果が得られました。平均収率は719 ngで、平均吸光度比は260 nm / 280 nmで1.98でした。

全体として、このデータセットは、提示されたプロトコルが、最小限の血液量、すなわち、複数の刺激および読み出しモダリティに対して合計8mLを使用して、さまざまな感染関連抗原の多面的な読み取りスペクトルおよび付随分析を可能にすることを示しています。

抗原刺激全血を用いたワクチン接種反応を追跡するための転写解析のための代表的なデータセット
抗原刺激全血で実施された転写研究の原理証明として、BNT162b2(SARS-CoV-2 mRNAワクチン)による最初のブースターワクチン接種の直前と1か月後に9人の健康な成人被験者から血液が採取されました32,33 最初の2回接種ワクチンシリーズの7〜9か月後。500 μL の非刺激およびProt_S刺激の全血からの平均 RNA 収量は、高純度 RNA 1.1 μg で、平均 260/280 吸収比は 1.99 でした。nCounter解析後、RNAカウントはパネルの12のハウスキーピング遺伝子(幾何平均)に正規化されました。その後、Prot_S刺激したサンプルと非刺激バックグラウンドコントロールの正規化されたmRNA数の比率を、各被験者および遺伝子について決定しました。ワクチン接種後とワクチン接種前の測定値の中央値と中央値の比率を決定し、物質表に記載されているソフトウェアパッケージを使用して経路濃縮分析を行いました。標準的な経路の濃縮は、絶対zスコア値が1.25≥、Benjamini-Hochberg調整p<値が0.05有意であると考えられていました。有意に異なる濃縮経路を図4Aにまとめ、Prot_Sに対するワクチン接種後とワクチン接種前の反応のバックグラウンド調整変化の簡略化されたネットワークを図4Bに示します。さらに、抗原提示細胞の成熟およびブースターワクチン接種後のProt_S誘導性T細胞活性化に関連する代表遺伝子のより強力なバックグラウンド調整誘導が図4C<に示されている。最後に、ほとんどのドナーにおけるワクチン接種後のバックグラウンド調整済みProt_S特異的1型ヘルパーT細胞(CD69+IFN-γ+)の増加が、第2セットの刺激チューブを用いたフローサイトメトリーによって確認されました(p = 0.03、図4D)。

フルスケールおよび少量の全血ベースの免疫測定プロトコルにおけるウイルス反応性T細胞応答の比較
次に、健康なボランティアにおけるウイルス反応性CD154+IFN-γ+ Tヘルパー細胞(CD3+CD4+ 細胞)の頻度を、フルスケール(500 μL、WB)および少量(250 μL、WBS)の全血抗原刺激プロトコルを使用して比較しました(図5)。以前に報告された34ように、CD154+IFN-γ+ 細胞の最小の非特異的バックグラウンド頻度は、二重共刺激(平均、WBおよびWBSでそれぞれ0.010および0.011%)にもかかわらず、どちらのプロトコルでも観察された。注目すべきは、非特異的なバックグラウンド応答が抗原特異的応答から差し引かれているにもかかわらず、前述のように、アッセイの不正確さの増加に寄与していることである27。バックグラウンドシグナルの上昇(すなわち、>0.07-0.1%CD154+ Th細胞または>.05%CD154+IFN-γ+ 細胞)は、サンプルの汚染、被験者の急性感染を示しているか、または不適切な分析前のサンプル取り扱いの結果である可能性があります。

血清陽性ドナー(n = 5)におけるHSV溶解物反応性T細胞の平均頻度は、WBおよびWBSシステムでそれぞれ0.151%および0.107%であったのに対し、血清陰性ドナー(n = 4)では0.012%および0.004%であった。CMV pp65ペプチドプールでは、血清陽性ドナー(n = 4)の反応性T細胞は0.041%および0.049%であったのに対し、血清陰性ドナー(n = 5)では0.001%および0.004%であった。Linの一致相関係数は、HSVで0.868、CMVで0.985であり、強い相関関係が示唆されています(図5A)。特に、CMV特異的T細胞検査は、最近再活性化イベントがなかった健康な血清陽性被験者では陰性である可能性があります。総レパトイアと抗原反応性CD3+CD4+ Tヘルパー細胞のレパトアの両方を、CCR7およびCD45ROの発現に基づいてさらに分化させました(図5B)。心強いことに、WBプロトコルとWBSプロトコルを使用して得られた結果は、総集団と抗原反応性集団の両方で同等でした。予想されたように、どちらのアッセイでも、より分化したメモリーTh細胞(すなわち、エフェクターメモリー細胞)の割合は、抗原反応性T細胞の方が全Th細胞集団よりも高かった。予想通り、ウイルス刺激剤によって活性化されたナイーブT細胞はごくわずかでした(図5B)。

さらに、別の一連の実験では、刺激された培養上清をIFN-γ ELISAによって分析しました(図5C)。最小の非特異的バックグラウンドが見られました(WBおよびWBSプロトコルでそれぞれ1.29 pg/mLおよび2.18 pg/mLの平均)。HSV血清陽性ドナーからの血液サンプルは、WBおよびWBSシステムでそれぞれ111 pg / mLおよび125 pg / mLのバックグラウンド調整HSV誘発IFN-γ濃度の平均を示しました。対照的に、血清陰性サンプル中の IFN-γ 濃度は、両方のシステムで一貫して 10 pg/mL 未満でした(Lin の一致相関係数 = 0.972、 図 5C)。同様に、CMV血清陽性ドナーからのpp65刺激血液は、WBおよびWBSシステムでそれぞれ258 pg/mLおよび272 pg/mLの平均IFN-γ濃度をもたらしましたが、血清陰性サンプルを使用した両システムでは、pp65によるIFN-γ分泌が最小限に見られました(Linの一致相関係数= 0.953、 図5C)。

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図1:実験手順と読み出しをまとめたフローチャート。 アスタリスクは、一部のT細胞活性化マーカー(CD154など)および細胞内サイトカイン染色にブレフェルジンAが必要であることを意味します。プロトコルのステップ 2.5 と 2.6 を参照してください。#:フローサイトメトリー用の血液は、赤血球溶解のために最初に15 mLの遠心チューブに移されますが、サイトカインアッセイおよびトランスクリプトミクス用の血液は1.5 mLの微量遠心チューブに移されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:赤血球溶解。刺激された血液を(A)赤血球溶解バッファーに再懸濁した後、(B)流体が透明に見えるまでインキュベートしますが、6分以内です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:代表的なデータセットとフローサイトメトリーゲーティングの概略図(A)一重項イベントは、FSC-AおよびFSC-Hの特性によって識別されます。そのうち、リンパ球はFSC-AとSSC-Aを使用してゲートされます。リンパ球はCD3+CD4+ヘルパーT細胞に分化します。CD45ROおよびCCR7の発現レベルは、記憶細胞集団およびエフェクター細胞集団の表現型解析に使用されます。活性化マーカーとしてIFN-γとCD154を用いた。ゲートは、非刺激サンプル中のIFN-γ-CD154-集団に基づいて設定されました。その後、ゲートを刺激されたサンプルに移しました(B)。活性化T細胞のメモリー集団の特性評価は、CCR7/CD45RO象限ゲートをCD3+CD4+集団からIFN-γ+CD154+CD3+CD4+集団に移すことによって達成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:SARS-CoV-2ブースターワクチン接種後の抗原誘導性転写変化 (A)BNT162b2 mRNAブースターワクチン接種後と(初回)のSARS-CoV-2スパイクタンパク質(Prot_S)刺激全血における転写経路のバックグラウンド調整濃縮を、9人の健康な成人被験者で分析した。Benjamini-Hochberg調整済み（BH調整）p値<0.05（-log10[BH調整済みp]>1.3)および絶対zスコア>1.25)の免疫関連標準経路が示されている。(B)ブースターワクチン接種後とブースターワクチン接種前と比較して、S刺激全血でより強く濃縮された遺伝子と経路を要約した簡略化されたネットワーク。(C)ブースターワクチン接種前後のProt_S刺激全血における抗原提示およびT細胞活性化に関連する代表遺伝子のバックグラウンド調整発現レベル。対応のあるウィルコクソン検定。(D)ブースターワクチン接種前後のProt_S特異的IFN-γ+CD69+ T細胞のバックグラウンド補正頻度。対応のあるウィルコクソン検定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:フローサイトメトリーおよびELISAにおける抗ウイルスT細胞の反応性。 (A)確立された(WB)および少量(WBS)全血アッセイからのバックグラウンド補正されたCD154+IFN-γ+/CD3+CD4+ T細胞頻度(フローサイトメトリー)の相関プロットが示されています。緑の点と赤の点は、それぞれ試験されたウイルスに対して血清陰性と血清陽性の被験者を表しています。(B)CD45ROおよびCCR7発現のフローサイトメトリー評価を用いて、血清陽性ドナーの血液を用いてHSVライセートまたはCMV pp65で刺激した後、全球のCD3+CD4+ T細胞および抗原反応性IFN-γ+CD154+CD3+CD4+ T細胞のメモリー/エフェクターT細胞表現型を決定した(それぞれn = 5および4)。平均分布が表示されます。緑:ナイーブT細胞(TN)、CD45RO-CCR7+。灰色:中央記憶T細胞(TCM)、CD45RO+CCR7+。青:エフェクターメモリーT細胞(TEM)、CD45RO+CCR7-。オレンジ:エフェクターT細胞およびCD45RA(TE / TEMRA)、CD45RO-CCR7-を再発現するエフェクターメモリーT細胞。(C)WBおよびWBSアッセイを使用して測定されたバックグラウンド補正IFN-γ放出(ELISA)の相関プロット。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:刺激チューブの内容物。 刺激と溶媒のストック濃度がまとめられています。フルスケールの全血アッセイ(WB)は、500μLのリチウムヘパリン全血を使用して実行されますが、小規模バージョン(WBS)はわずか250μLの血液を必要とします。WBSの場合、すべての試薬容量はWB容量の半分です。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:代表的なデータセットを生成するためにサンプリングされた健康な成人被験者の人口統計データ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:T細胞解析用の代表的なフローサイトメトリーパネル。 このフローサイトメトリーパネルは、代表的なデータセットを生成するために使用されています。結果を 図 3 に詳細に示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4:以前に公開されたフローサイトメトリーパネル。 これらの抗体の組み合わせを用いたデータは、以前にTappe et al.24によって発表されています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

抗原特異的イムノアッセイは、宿主と微生物の相互作用に関する洞察を提供し、ワクチン接種および免疫療法の研究にとって極めて重要であり、日和見感染症患者の診断および予後診断法としてますます認識されるようになっています35。このプロトコルは、最小限の血液量(抗原あたり250-500μL)を使用して抗原特異的免疫の堅牢でマルチモーダルな分析を可能にする簡単な抗原刺激システムについて説明しています。250 μLのプロトコルを縮小した結果、以前に確立された500 μLのプロトコルと比較して、抗原特異的なT細胞の頻度、表現型、およびサイトカイン産生の相関が良好に示されました。サンプル処理36のいくつかのステップで少量の溶液が利用可能であるにもかかわらず、著者の知る限り、現在利用可能な市販のシステムは、フローサイトメトリー、サイトカイン放出アッセイ、および250〜500μLの血液量からのトランスクリプトミクスによるT細胞駆動型機能免疫応答の抗原刺激および多面的な機能解析を確実にサポートできるものではない。同様の研究アプリケーションの範囲を促進する最も広く使用されている商用システムは、3mLの刺激環境で1mLの血液量を使用するため、ここで提示したプロトコル13,14,15と比較して、必要な抗原のコストと量がかなり高くなります。

抗原特異的T細胞6,37,38のフローサイトメトリー定量のための全血ベースのプロトコルの継続的な最適化にもかかわらず、フローサイトメトリー測定にはいくつかの欠点があります。特に、それらは本質的に手間がかかり、オペレーター間の大きなばらつき(主観的なゲートプロセスなど)や、ラボ間で機器のセットアップ、補正プロトコル、および取得パラメータが異なるため、標準化が困難です。標準化された報告39および自動解析およびゲーティングソフトウェアの使用は、ますます複雑化するマルチカラーデータセット40,41の標準化および比較可能性を改善するかもしれないが、ここで説明する刺激プロトコルは、種々の非フローサイトメトリー読み出しモダリティに対応するように設計されている。

特に、サイトカイン放出アッセイは、手軽なハンズオン時間と比較的安価な機器で実施でき、多くの場合、日常的な臨床アプリケーション向けに容易に標準化されています。さらに、このプロトコルを使用した以前の研究で示されたように、最新のマルチプレックスアッセイでは、最小限のサンプル量から多数のサイトカイン応答を測定できるため、研究環境での複雑なサイトカインシグネチャーのプロファイリングが可能になります24,42。注目すべきは、二重共刺激によるこの堅牢なプロトコルにより、非リンパ球症患者(>800リンパ球/μL血液)における抗原特異的サイトカイン応答の信頼性の高い定量化が容易になることです。医原性免疫抑制を受けている患者でも26,34。サイトカイン放出アッセイの欠点として、特に白血球減少症の患者では、分泌されたサイトカインを個々の細胞集団に追跡することができません。場合によっては、細胞特異的な刺激(利用可能な場合)を使用することで、これを軽減できる場合があります。ただし、サイトカイン濃度と他の読み取りモダリティとの組み合わせ、および/または臨床血液学に基づくサイトカイン応答の調整(すなわち、白血球分化を伴う全血球計算)が必要になる場合があります。特に、ここで紹介するプロトコールでは、同じサンプルからのサイトカインの読み出しと転写シグネチャーの組み合わせが可能であるため、グローバルサイトカインシグネチャーに細胞のコンテキストと特異性を追加できる可能性のある明確に定義された転写活性化マーカーの一致した解析が可能になります。

完全な標準化とさらに優れた臨床実践性に向けた将来のステップは、サンプル処理から分析物の読み取りまで、これらのアッセイを完全に自動化することです。個々の細胞集団の正確な自動単離が成功裏に確立されているにもかかわらず43,44、抗原特異的T細胞解析では、実験室の担当者が断続的な取り扱い手順を踏む必要があります。しかし、細胞の単離や脆弱なPBMCの取り扱いを省略し、市販の自動化に対応した刺激チューブを使用することで、機能的なイムノアッセイのためのシンプルで完全に自動化された全血ベースのワークフローの実施が容易になるかもしれません。

全体として、本明細書で紹介されているような汎用性の高い全血ベースのプロトコルは、抗原特異的機能免疫測定法のアプリケーションを、小動物での前臨床試験を含む新しい患者コホートや研究分野に拡大する大きな可能性を秘めています。抗原特異的な機能的免疫測定法は、現在、マウスモデルではほとんど実行不可能であり、数匹の動物からの血液のプールや、脾細胞などの標準化されていない細胞抽出物の使用が必要です。日和見感染に対する宿主防御力を高めるための免疫療法的介入(免疫チェックポイント阻害剤、造血増殖因子、サイトカインなど)への関心の高まりや、革新的なワクチン接種技術の急増を考えると、抗原特異的機能免疫測定法は、前臨床感染症の研究と多様な患者集団における臨床応用の両方でますます重要な役割を果たすことが期待されています。ここで紹介する堅牢で安価、使いやすく、少量の抗原刺激システムは、未開拓の領域での包括的な抗原特異的免疫解析を促進する可能性があります。さらに、この簡便なプロトコルの解析前の堅牢性により、イムノアッセイアプリケーションを臨床ルーチンに適切に組み込む機会が生まれ、パーソナライズされたバイオマーカー主導の感染症管理に一歩近づくことができるかもしれません。

開示事項

著者が開示すべき利益相反はありません。

謝辞

血清抗体測定を実施してくださったアウグスブルク大学病院臨床医学微生物研究所の臨床化学および感染血清学部門に感謝します。トランスクリプトミクス施設を提供してくださったFriederike Liesche-Starnecker博士とアウグスブルク大学病院の病理学・分子診断研究所に感謝します。アウグスブルク大学病院のMarie Freitag氏には、ワクチン接種のロジスティクスとサンプル取得をサポートしていただいたことに感謝します。オラフ・クニーマイヤー博士とドイツのイェーナにあるハンス・クノール研究所に 、Aspergillus fumigatus lysateを提供していただいたことに感謝します。この研究は、研究イニシアチブBay-VOC(資金番号GE2-2452-200-D37666/2022)、バイエルン州科学芸術省、およびドイツのアウグスブルク大学が支援しました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
7-AAD SolutionMiltenyi Biotec130-111-568
Anti-IFN-g-PE, human, REA600, 100 testsMiltenyi Biotec130-113-498
Aspergillus fumigatus lysateN/AN/AKindly provided by the Hans-Knoell Institute Jena, Germany
Brilliant Violet 650 anti-human CD197 (CCR7) AntibodyBioLegend353234
Buffer ELQiagen79217Erythrocyte lysis buffer
CD154-PE-Vio770, human, REA238, 100 testsMiltenyi Biotec130-113-614
CD279 (PD1)-VioBright 515, human, 100 testsMiltenyi Biotec130-120-386
CD28 pure, human - functional gradeMiltenyi Biotec130-093-375
CD3-VioBright R720, human, REA613, 100 testsMiltenyi Biotec130-127-377
CD45RO-APC-Vio770, human, REA611, 100 testsMiltenyi Biotec130-113-557
CD49d pure, humanMiltenyi Biotec130-093-279
CD4-VioBlue, human, REA623, 100 testsMiltenyi Biotec130-114-534
CD69-PE-Vio615, human, REA824, 100 testsMiltenyi Biotec130-112-617
CO2 IncubatorPHCbiMCO-170AICD-PE
CPI Positive Control SolutionImmunoSpotCTL-CPI-001
CRX-527Invivogentlrl-crx527
CytExpert Acquisition and Analysis SoftwareBeckman CoulterVersion 2.4Flow cytometer operating softwware
CytoFlex S B2-R3-V4-Y4Beckman CoulterB75408Flow cytometer
GraphPad PrismGraphPadVersion 10.1.0
Herpes simplex virus 1 lysateAID Autoimmun DiagnostikaELSP 5916K
HU IFN G Uncoated ELISA 2X96T PLTThermo Fisher Scientific88-7316-22
HydroFLex Microplate WasherTecan30220085
Infinite M PlexTecan30213614Multimode Microplate Reader
Kaluza Analysis SoftwareBeckman CoulterVersion 2.1.00003.20057Flow cytometric data analysis software
MACS Inside Stain KitMiltenyi Biotec130-090-477
Mastercycler X50lEppendorf6303000010
Nanodrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-W
nCounter Sprint CartridgeNanostring100078
nCounter Sprint ProfilerNanostring100170
nCounter Sprint Reagent PackNanostring100077
nSolverNanostringVersion 4.0Nanostring nCounter data analysis software
Octeniderm farblos 250 ml FLSchuelke118211
Omnifix F Solo, 1 ml, ohne Kanüle, 3-teiligBraun9161406VSyringes
PepTivator CMV pp65, human, 60nmolMiltenyi Biotec130-093-435
PepTivator SARS-CoV-2 Prot_S, research grade, for stimulation of 1×108 cellsMiltenyi Biotec130-126-700
QIAshredderQiagen79654
RNA ProtectQiagen76526
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPESThermo Fisher Scientific72400047
Safe 2020 1.5 Microbiological Safety CabinetThermo Fisher Scientific51026959
S-Monovette lithium-heparin, 4.9 mlSarstedt04.1939.001Blood collection tubes
S-Monovette neutral, 2.7 mlSarstedt05.1729Stimulation environment tubes
Sterican Safety G 19 x 1 1/2'' 1,1 x 40 mmBraun4670052S-01Needles
Stop Solution, 100 MLThermo Fisher ScientificBMS409.0100
Wash Buffer 20X, 500 MLThermo Fisher ScientificBMS408.0500
Water, 1 lCarl Roth3478.1
XT Hs Exhaustion CSONanostring115000466Nanostring Immune Exhaustion Panel

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