レンチウイルス感染の場合は、トリプシン処理したMPNST標的細胞をカウントした後、15センチメートルのディッシュあたり250万個の細胞を維持してプレーティングします。融解したウイルスを、カチオン性ポリマー1ミリリットルあたり5マイクログラムの存在下で、0.5倍の感染で細胞を形質導入します。ピューロマイシン添加の3日後に細胞をトリプシン化する。
細胞集団の半分を200 Gで卓上遠心分離機で5分間遠心分離します。細胞集団の残りの半分を再播種した後、前に示したように、回収および遠心分離する前に、約7つの集団倍増のためにそれらを成長させます。所望の時間に対応する再懸濁細胞ペレットを2本の15ミリリットルポリメチルペンテンチューブに分割します。
チューブあたり500マイクロリットルの10%SDSを追加します。混合し、室温で5分間インキュベートします。チューブをDNA剪断装置に入れて、DNAを超音波処理します。
フェノールとクロロホルムの添加後。45〜60秒間、可能な限り最大速度で激しくボルテックスしてよく混ぜます。得られた透明な上相のうち 3 ミリリットルを各チューブから別の新しい 15 ミリリットルのチューブに移します。
0.5ミリリットルの3モル酢酸ナトリウムと4ミリリットルのイソプロパノールを加え、よく混ぜます。チューブを7、200g、20°Cで30分間遠心分離し、上清を廃棄した後、0.5ミリリットルの70%エタノールをペレットに加え、ピペッティングで上下させて取り除きます。両方のチューブから再懸濁したペレットを1.5ミリリットルの遠心分離チューブに混ぜ合わせます。
画面に表示された条件でPCR反応を行ってください。2回目のPCR反応の後、4つのサンプルを1本の微量遠心チューブに混ぜ合わせます。そしてそれに6Xのローディング染料の80マイクロリットルを加えます。
ゲルを可視化し、約250塩基対のバンドを確認します。4つの異なるBcl-6ショートヘアピンRNAを発現する非標的コントロールとレンチウイルスで形質導入したヒトMPNST細胞は、Bcl-6ショートヘアピンRNAのいくつかが細胞数を著しく減少させることを明らかにしました。免疫ブロットは、細胞数の減少の程度がBcl-6のノックダウンの程度と相関していることを示しました。
