Nous reconnaissons Bloomington centres de stockage pour la souche de mouche. Ce travail a été soutenu par subvention de recherche du BBSRC (BB / G008973 / 1).

1. Fly Préparation <ol><li> Se croiser tous les mutants, Gal4 / UAS et d&#39;autres lignes avec une souche de type sauvage, comme CSw-, pendant au moins six générations avant les expériences de comportement pour contrôler les antécédents génétiques 26. </li><li> Cultiver des mouches sur un régime standard de semoule de maïs, la levure et mélasse alimentaire sous un cycle lumière-obscurité de 12h12 h à 25 ° C, sauf manipulations spécifiques nécessitent une température différente. <ol><li> Pour déterminer les effets de l&#39;expression du transgène: utilisation de 18 ° C pour empêcher l&#39;expression de transgènes dans (le système Target) de Gal4 GAL80 par le développement et ensuite passer les mouches à un incubateur à 30 ° 1-2 jours avant l&#39;expérience comportementale. Conduite de l&#39;expérience à 30 ° C pour déterminer les effets de l&#39;expression du transgène 3,4,6,7,14. </li><li> Pour les expériences utilisant des canaux de TRPA1 activés par la chaleur pour stimuler les neurones: Augmenter les mouches à 23 ° C, ce qui est une température connuede maintenir un canal inactif, puis passer à une salle de comportement à 30 ° C pour activer le TRPA1 neurones exprimant. </li><li> Pour les expériences à l&#39;aide de la température Shibire sensible à bloquer la sortie synaptique 11, 14,24: arrière vol à 18 ° C et effectuer des tests à 30 ° C. </li></ol></li><li> Recueillir les mouches 1-2 jours avant l&#39;expérience et les compter par groupes d&#39;environ 25 sous CO lumière 2 anesthésie. Conserver les mouches au moins O / N dans des flacons de produits alimentaires (sans levure) à 25 ° C (à moins que des manipulations spécifiques nécessaires à une température différente) et l&#39;humidité 70% par rapport à une chambre à environnement contrôlé de lumière 12:12 h: l&#39;obscurité jusqu&#39;à ce que le temps de l&#39;expérience. Remarque: Ce stockage permet aux mouches de s&#39;acclimater à l&#39;épreuve de l&#39;apprentissage ultérieur effectué dans la chambre à environnement contrôlé, qui avait les conditions d&#39;apprentissage optimales drosophile et, surtout, supprime toute envi quotidienvariations environ- qui auraient pu influer sur le phénotype comportemental. </li></ol> 2 Préparation avant l&#39;expérience <ol><li> Réaliser les expériences dans un labyrinthe en T plexiglas sur mesure (Figure 1). </li><li> Vérifiez régulièrement le montage et assure que l&#39;étanchéité à l&#39;air est obtenu lors de l&#39;expérience tube. Si nécessaire, changer les joints toriques qui scellent les compartiments à l&#39;intérieur du labyrinthe en T. </li><li> Placer des grilles de cuivre sur mesure à l&#39;intérieur des tubes d&#39;entraînement. Vérifiez et nettoyez régulièrement ces grilles, et les remplacer si oxydé. Fixez les grilles de cuivre à fils par des pinces crocodiles qui fonctionnent à une boîte de commutateur connecté à un stimulateur électrique. Utilisez un voltmètre pour faire en sorte que l&#39;appareil délivre le choc nécessaire. </li><li> Utilisation de G-pinces pour tenir le labyrinthe étroitement pour éviter toute fuite d&#39;air. </li><li> Attacher le labyrinthe en T à un tube qui s&#39;étend à une pompe à air, pour permettre aux odeurs à tirer pour les mouches et ensuite retirés du labyrinthe en T. Maintenir l&#39;air doux~ s&#39;écouler à 2 L / min </li></ol> 3. Odeur dilutions <ol><li> Utilisez deux odeurs différentes à des concentrations telles que les mouches montrent une préférence égale pour les deux odeurs. Utilisez 4 méthylcyclohexanol (1:67) et 3-octanol (1: 100) diluée dans une huile minérale 7,13. Remarque: déterminer soigneusement ces concentrations qui varient par le laboratoire. Par exemple, d&#39;autres utilisent 1h10 pour les odeurs 24. D&#39;autres odeurs couramment utilisés comprennent l&#39;acétate d&#39;éthyle et l&#39;acétate d&#39;iso-amyle. </li><li> Introduire à la pipette 30 ul de l&#39;odeur dilué dans une odeur tasse-mesure placé dans un bloc d&#39;odeur couvert par un tube en matière plastique avec un dessus perforé qui permet à l&#39;air d&#39;être aspiré au-dessus de l&#39;odeur dans la coupe, exposant ainsi les mouches à un panache d&#39;odeur. </li></ol> 4 Protocole de formation (figures 1 et 2) <ol><li> Pour adultes olfactif choc conditionné, effectuer toutes les expériences sous une faible lumière rouge (c&#39;est à dire, LED rouge.), Ce qui permet au chercheur de voir mais empêche la fly de voir, ce qui permet aux mouches de se concentrer sur l&#39;olfaction, par opposition à des éléments visuels. </li><li> Présentez-vol dans le tube de la formation, puis fixez le labyrinthe en T et leur permettre de s&#39;adapter au tube et le débit d&#39;air pendant 90 secondes. </li><li> Présenter la première odeur (4 méthylcyclohexanol, MCH) avec un choc de 60 V (composé de douze impulsions 1,25 sec avec des intervalles inter-impulsions de 3,75 s) pour une durée totale de 60 secondes. </li><li> Suivez le choc avec une période de repos de 30 secondes sans une odeur ou un choc. </li><li> Présenter le deuxième odeur (3-octanol, OCT) pendant 60 secondes sans un choc. </li><li> Suivez le choc avec une période de repos de 30 secondes sans une odeur ou un choc. </li><li> Déplacez les mouches de la chambre de formation dans la chambre centrale du labyrinthe en T en tournant le labyrinthe en T sur le côté et doucement frapper le fond du labyrinthe en T sur une surface molle, comme un tapis de souris vieux. Maintenir les mouches dans la chambre centrale pendant 90 secondes. </li><li> Monter les tubes de choix dans la boTTOM de l&#39;appareil pour former le labyrinthe en T. </li><li> Pour mesurer l&#39;apprentissage, déplacer vol à la pointe de la T-labyrinthe, où ils ont été exposés simultanément à deux odeurs choix et d&#39;aller vers un. Procéder à une période d&#39;essai pendant 120 secondes. </li><li> Piège les mouches dans les tubes de choix en faisant glisser la chambre centrale jusqu&#39;à bloquant ainsi les extrémités des tubes de choix. Recueillir les mouches dans chaque bras du labyrinthe en T et dans le compartiment central dans des fioles de comptage et alimentaires. </li><li> Pour mesurer la mémoire, de recueillir les mouches après la formation (4.6) et les transférer dans le labyrinthe en T dans des flacons de produits alimentaires sans levure. Magasin vole dans l&#39;obscurité à 25 ° C et 70% d&#39;humidité pendant le temps nécessaire restant à déterminer la phase de la mémoire de l&#39;intérêt (voir introduction). Réintroduire les mouches au labyrinthe en T comme à l&#39;étape 4.7. </li><li> Pour la mémoire à long terme, utiliser un labyrinthe construit sur mesure qui permet à plusieurs lots de mouches à être formés simultanément. Administrer 5 cycles de formation de 15 minutes entre le cycle intervalle (spaced) ou sans intervalle entre les cycles (massé). Maintenir les mouches à 18 ° C et 70% d&#39;humidité dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à ce que les tests. Avant les essais, déplacer les mouches à 25 ° C et leur permettre de s&#39;acclimater pendant au moins 1 h. Évaluer la mémoire à long terme de 24 heures après la formation. </li><li> Après les expériences comportementales, nettoyer les tasses odeur avec de l&#39;eau chaude et du détergent inodore. Après séchage, enduire les tasses avec 10 ul Sigmacote. Sécher le Sigmacote par chauffage dans un four à micro-ondes. Nettoyez de temps à la T-labyrinthe tubes de plexiglas et des blocs d&#39;odeur avec de l&#39;eau chaude et du détergent inodore. </li></ol> 5 Calcul de l&#39;indice de performance: une mesure de la mémoire de mouches <ol><li> Calculer l&#39;indice de performance (PI) pour chaque condition que le nombre de mouches éviter l&#39;odeur de choc appariées (CS -) moins le nombre de mouches qui choisissent l&#39;odeur de choc appariées (CS +) divisé par le nombre total de mouches (CS - + CS +) 1. Peindice de rfo rm a n (PI) = (# CS - vole - # CS + vole) / (# mouches totales) </li><li> Calculer la PI final de l&#39;expérience en faisant la moyenne de la PI de l&#39;expérience dans laquelle MCH était l&#39;odeur de choc appariées et dans lequel une octobre était l&#39;odeur de choc appariées. Cela supprime toute partialité de vol ayant une plus grande préférence pour une odeur. </li></ol> 6.Contrôle sensorimotrices <ol><li> Effectuer odeur acuité en introduisant ~ 40-50 mouches dans le labyrinthe en T 6,7,17. </li><li> Après 90 secondes, déplacer vol au point de choix, et leur permettre de 2 min à choisir entre les odeurs pures et de l&#39;air. </li><li> Recueillir et compter les mouches. Calculer le pourcentage d&#39;évitement en divisant le nombre total de mouches qui ont choisi l&#39;odeur par ceux qui ont participé au test. </li><li> Pour le choc réactivité 6,7,17, introduire les mouches dans la chambre de choc. </li><li> Après 90 secondes de repos, administrer un choc électrique de 60 V DC, à partir de laquelle les mouches peuvent échapper à une semblabletube sans un choc. </li><li> Laisser 2 min pour les mouches de choisir; recueillir et compter les mouches. Calculer le pourcentage choc d&#39;évitement en divisant le nombre de mouches qui ont évité le choc en s&#39;échappant du tube de choc par le nombre total de mouches dans l&#39;expérience. Inclure les mouches qui restent dans la chambre centrale dans le total de ceux qui ont échappé à la décharge électrique. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

La drosophile adulte choc olfactif test d&#39;apprentissage présenté ici permet d&#39;analyser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les différentes phases de la mémoire, y compris la mémoire à long terme 15-17. En plus de la détermination de l&#39;effet du rythme circadien du sommeil 18, 19, 20,21, la sénescence alimentation 11-13, les maladies neurodégénératives et 5 traitements médicamenteux 5,6,19 sur la mémoire. De nombreuses approches puissantes ont été récemment mis au point pour l&#39;imagerie fonctionnelle des circuits neuronaux qui interviennent dans la mémoire olfactive chez les mouches 3,4,7,11,16,27. Ces techniques utilisent optogénétiques le vaste répertoire des promoteurs différents disponibles chez la drosophile 14,16. Ces promoteurs sont utilisés pour exprimer codés génétiquement calcium et l&#39;AMPc journalistes dans les neurones de la mémoire 16,27 pour étudier l&#39;effet de mutations génétiques spécifiques sur les traces de la mémoire. Thl&#39;utilisation de l&#39;e des promoteurs et des mutations conditionnelles chez les adultes permet l&#39;étude du rôle post-développement d&#39;un produit de gène dans la mémoire 3,4,6,7,13,14. Imagerie et approches comportementales peuvent être combinés avec les canaux à la lumière et à la chaleur activé pour stimuler ou inhiber des neurones différents dans le circuit de mémoire 11,14,16,22-24 à élucider leur fonction. En outre, les neurones de la mémoire du corps de champignon sont accessibles aux cellules entières des enregistrements de patch-clamp 28 et de techniques mathématiques et informatiques sont utilisés pour modéliser la mémoire olfactive chez la drosophile 29. Ces avancées expérimentales, combinées avec les différentes formes de protocoles de mémoire associative présentés ici, permettent la drosophile à être utilisé pour modéliser les molecular- et niveau circuit changements dans la mémoire associative qui se produisent en réponse à récompenser, la peine, la motivation, la toxicomanie, le vieillissement et la maladie 5,6,11-13,16,30-31.

La méthode présentée ici est celle décrite par Tully et Quinn avec quelques petites modifications 1. L&#39;expérience est réalisée en deux phases: les mouches sont formés dans la première phase, et les mouches formés sont testés dans la deuxième phase. Pendant la formation, un groupe de mouches sont simultanément exposés à l&#39;odeur 1 (CS +) et un choc électrique (États-Unis) dans un tube de formation. Les mouches reçoivent alors l&#39;odeur 2 (CS -) sans un choc électrique. Cette association unique d&#39;une odeur particulière avec un choc est appelé formation 1 cycle, et les odeurs qui sont les plus fréquemment utilisés sont 4 méthylcyclohexanol (SMI) et 3-octanol (OCT). Une formation de cycle conduit à la formation d&#39;une phase labile de mémoire qui peut être détecté jusqu&#39;à 7 h; Toutefois, la mémoire est généralement testé immédiatement pour déterminer ce que l&#39;on appelle l&#39;apprentissage, l&#39;acquisition ou la mémoire de 2 min. Mémoire mesurée à 30 min ou 1 h est appelée mémoire à court terme, alors que3 h mémoire est appelée mémoire à mi-parcours. L&#39;exposition des mouches à des cycles de formation répétitives avec des écarts entre les cycles de formation (formation à distance) conduit à une forme consolidée de la mémoire à long terme qui est la transcription CREB dépendante et dure jusqu&#39;à une semaine. Entraînement sans lacunes (formation massée) conduit à la formation de la mémoire d&#39;anesthésie-résistant (ARM), qui semblable à la mémoire à long terme, est généralement mesurée 24 h après 5 cycles de formation 7,13,15-17,20,21. Avec cette approche, l&#39;effet de différentes mutations du gène de ces différentes phases de la mémoire peut être déterminée. L&#39;expression de promoteur mécanique de transgènes légers ou sensibles à la température d&#39;activer ou de bloquer l&#39;activité neuronale de neurones spécifiques permet d&#39;enquêter sur les neurones sont nécessaires pour l&#39;acquisition de la mémoire, la consolidation et la récupération 3,4,11,15,16,20, 22-24. Mémoire à 1 h est généralement mesurée en étudiant la perte de mémoire liée à l&#39;âge, car ce form de mémoire apparaît particulièrement vulnérables aux effets du vieillissement 11-13. Une gamme complète de contrôles comportementaux et génétiques sont réalisées avec des expériences de mémoire, par exemple, pour déterminer si un défaut de performance est en raison d&#39;un défaut de mémoire centrale ou un déficit sensoriel périphérique qui empêche la mouche de sentir le choc ou repère olfactif 5 -7, 1 7, 25,26.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:28px;">Materials</td>
			<td style="width:139px;height:28px;">Source</td>
			<td style="width:116px;height:28px;">Cat. No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">3-Octanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">218405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">4-Methyl cyclohexanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">15,309-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Benzaldehyde</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">418099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Fluka</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">BP2629-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Hexyl acetate</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">108154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Fructose</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:22px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;height:22px;">Bioline</td>
			<td style="width:116px;height:22px;">BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila adult olfactory shock learning

Drosophile ont été utilisés dans des expériences de conditionnement classiques pour plus de 40 ans, ce qui facilite grandement notre compréhension de la mémoire, y compris l&#39;élucidation des mécanismes moléculaires impliqués dans les maladies cognitives 1-7. L&#39;apprentissage et la mémoire peuvent être analysés dans les larves d&#39;étudier l&#39;effet des gènes du développement neurologique 8-10 et en vol de mesurer la contribution des gènes de plasticité adultes 1-7. En outre, la courte durée de vie de la drosophile facilite l&#39;analyse de gènes médiant la mémoire liée à l&#39;âge déficience 5,11-13. La disponibilité de nombreux promoteurs inductibles qui subdivisent le système nerveux Drosophila permet de déterminer quand et où un gène d&#39;intérêt est nécessaire pour la mémoire normale ainsi que relais de différents aspects du signal de renforcement 3,4,14,16. Mémoire Étudier au drosophile adulte permet une analyse détaillée de lale comportement et les circuits impliqués et une mesure de la mémoire à long terme 15 -17. La longueur du stade adulte reçoit les manipulations génétiques, comportementaux, alimentaires et pharmacologiques à long terme de la mémoire, en plus de la détermination de l&#39;effet du vieillissement et des maladies neurodégénératives de mémoire 3-6,11-13,15-21. Le conditionnement classique est induite par la présentation simultanée d&#39;une information neutre d&#39;odeur (stimulus conditionné, CS +) et un stimulus de renforcement, par exemple., Un choc électrique ou saccharose, (stimulus inconditionnel, États-Unis), que d&#39;être associées les unes aux autres par l&#39;animal 1,16. Un stimulus deuxième conditionné (CS -) est ensuite présenté sans les Etats-Unis. Pendant la phase de test, la drosophile sont simultanément présenté avec CS + et CS-odeurs. Après le temps de Drosophila sont prévus pour choisir entre les odeurs, la distribution des animaux est enregistrée. Cette procédure albas associatives déconditionnement ou d&#39;appétence pour être évaluée de façon fiable sans un biais introduit par la préférence innée pour l&#39;une des stimuli conditionnés. Plusieurs expériences témoins sont également réalisées pour tester si les génotypes répondent normalement à l&#39;odeur et au renforcement seul.

L&#39;indice de performance (CP) sert de mesure de la mémoire. Le tableau 1 illustre un calcul représentant de PI. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MCH jumelé avec choc </td><td> 3-OCT jumelé avec choc </td></tr><tr><td> Les mouches en évitant MCH (dans l&#39;OCT tubes) = 80 Les mouches préférant MCH (MCH tubes) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6 </td><td> Les mouches en évitant OCT (MCH tubes) = 75 Les mouches préférant OCT (dans l&#39;OCT tubes) = 25 PI = 2 (75-25) / (75 + 25) = 0,5 </td></tr><tr><td> PI de l&#39;expérience = (0,6 + 0,5) /2=0.55 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1 A représentant de calcul de l&#39;indice de performance à partir de données d&#39;illustration. Indices de performance pour les différentes expériences peut être comparée à élucider les effets de mémoire. Une fois cettecomparaison est illustré à la figure 3, qui contient les résultats d&#39;une série d&#39;expériences effectuées avec le canton de S de type sauvage mouches adultes (WT) et cancre apprentissage adulte mutant vole 1. La moyenne de 10 IP est fourni, avec des barres d&#39;erreur représentent l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM). Ces résultats démontrent que les mouches âne montrent une réduction de l&#39;apprentissage par rapport au type sauvage. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1.jpg" /> Figure 1: L&#39;adulte expérimental. Les mouches sont formés et testés dans un labyrinthe en T. La formation consiste à présenter une odeur A avec un choc électrique suivie d&#39;une seconde odeur B sans choc électrique. Après une période de repos dans la chambre du milieu les mouches sont présentés à la fois les odeurs simultanément. Les mouches sont piégésdans les deux tubes et recueilli et compté à obtenir des scores d&#39;apprentissage / mémoire. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2.jpg" /> Figure 2: Le protocole de formation d&#39;un adulte. Les mouches sont la formation en deux étapes. La première étape où les mouches reçoivent une odeur (CS +) associé à un choc électrique (États-Unis) pendant 60 secondes. Dans l&#39;étape suivante mouches reçoivent une deuxième odeur (CS) sans choc électrique. Les mouches sont ensuite laissées au repos pendant 90 secondes, après quoi ils sont testés pour leur choix entre CS et CS +. <img alt="Figure 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig3highres.jpg" width="400" /> Figure 3 Un graphique représentatif montrant cancre et de l&#39;apprentissage de type sauvage dans la drosophile adulte. </strong&gt; WT et âne vol ont été testés suivant une session de formation. Cancre mouches montrent une réduction de l&#39;apprentissage par rapport au WT (n = 10).

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Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

La méthode de mesure de la drosophile adulte mémoire associative est décrite. L&#39;essai est basé sur la capacité de la mouche à associer une odeur présenté avec un renforcement négatif (choc électrique) et ensuite rappeler cette information à un moment ultérieur, ce qui permet à la mémoire mesurée.

Drosophile adulte olfactive apprentissage choc

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

drosophila-adult-olfactory-shock-learning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

27.7K vues.  University of Bristol.  La méthode de mesure de la drosophile adulte mémoire associative est décrite. L'essai est basé sur la capacité de la mouche à associer une odeur présenté avec un renforcement négatif (choc électrique) et ensuite rappeler cette information à un moment ultérieur, ce qui permet à la mémoire mesurée. 

Vidéo: Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Déficits locomoteur Dosage, apprentissage et mémoire dans Drosophile Modèles de la neurodégénérescence

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Recherche

Neurosciences

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appétitive apprentissage olfactif associatif en<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Méthode électrophysiologique de réponses d&#39;enregistrement intracellulaire tension de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportements olfactifs dosées par Tracking Computer Of<em&gt; Drosophila</em&gt; Dans un Olfactométre quatre quadrants

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Goût préférence Essai pour adultes<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Drosophila Courtship Conditionnement en tant que mesure de l&#39;apprentissage et de la mémoire

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.