サポートされるこの作品は、助成金番号EFRI 0938047の下で国立科学財団によって部分的にサポートされ、重要な技術と応用科学のためのバージニア工科大学（ICTAS）によってされています。著者は、MOSE-L細胞のその種類のギフトのために博士エヴァSchmelz博士とポール·ロバーツへの感謝の意を表したいと思います。著者は、彼女のこの文書を編集し、実験の準備から彼女の助けのための細胞培養、Caitlan Swaffarの支援、およびすべてBioelectromechanicalシステム研究室メンバーのアンジェラ·アンダーソンを認める。

1。概要：プロトタイプのcDEPマイクロ流体デバイスを製造<ol><li>フォローは、以前に、シリコンウェハ（ 図2）内に所望のチャネル設計（ 図1）をエッチングするためにフォトレジスト及びディープ反応性イオンエッチング（DRIE）を使用して、手順22を報告した。ウェハからマイクロデバイスの放出を改善するためにテフロン（登録商標）の薄い層を堆積させる。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig1.jpg" /> 図1。低周波数の概略連続選別装置。サンプルチャネルが実行されると、左から右へと100μmのノコギリくびれと500μm幅です。流体の電極チャネルの2対はそれぞれ、ソースとシンクの電極を構成し、厚さ20μmのPDMSバリアによって試料流路から分離される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig2.jpg" /> 図2。 fabrのcDEP装置のication工程であって、（a）60秒の場合、UV光を選択的にのcDEP装置の幾何学的形状のマスクパターンを介して露光されたフォトレジストと反応し、（b）はフォトレジストを現像液を用いて除去される。（c）のディープ反応性イオンエッチング（DRIE） 50μmの深特徴をエッチングするために使用され、70°Cでの水酸化テトラメチルアンモニウム（TMAH）によるウェットエッチングを5分間25％側壁の粗さを低減するために使用される。（d）にテフロンコーティングがからデバイスの放出を改善するために添加されウェハ。（e）は PDMSを脱気した後に再使用可能なウエハスタンプ上に注ぎ、100°F（f）は、PDMSがウェハから除去されるで45分間硬化される。 PDMS及び清潔なガラススライドを2分間、空気プラズマに曝され、接合されている。 <ol start="2"><li>波及を防ぐために、アルミホイルでウェーハをラップします。約20分間脱ガス、硬化剤とエラストマーの10:1の比で、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を混合する、及びウエハ上に注ぐ。スタンプのテフロンコーティングの損傷を回避するために、100℃で45分間加熱する。デバイスを冷却することができます。 </li><li>冷却後、アルミニウム箔を除去する外科用ブレードを用いてPDMSをトリミングし、管の大きさに適した平滑パンチャーを用いてチャネル入口/出口のアクセス穴パンチ。ここでは1.5mmで平滑パンチャーを使用する。 </li><li>それぞれの水と石鹸リンス、エタノール、DI水、空気と乾燥を使用して、ガラス顕微鏡スライドを清掃してください。スコッチマジックテープを使用したPDMSデバイスを清掃してください。チャンネルが汚れていないことを確認するために、顕微鏡下で調べる。 2分間、空気プラズマにスライドとPDMSデバイスを公開します。しっかりとスライド装置（ 図3）との間の気泡の形成を回避し、スライドガラスにデバイスのチャネル側を押してください。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg"/> 図3。 </st栄&gt;（A）、シリコンウェーハスタンプ製作、およびサンプルをそれぞれ緑と赤の食品着色料で満たさ流体電極チャンネル（B）、完成したPDMS-ガラスデバイスの間に、フォトリソグラフィに使用されるマスク。寸法については図1を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig3highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 2。 DEPバッファ中の細胞懸濁液を準備する<ol><li> 「DEPバッファ」と呼ぶことにする低伝導率を作製（100μS/ cm）で緩衝液（8.5％スクロースの[w / v]で、0.3％グルコースの[w / v]で、0.725パーセントRPMI [重量/容量]） 。16 </li><li> 3×10 6細胞/ mlでDEP緩衝液中で細胞を懸濁する。ここでは、癌末期のマウスの卵巣表面上皮（MOSE-L）細胞が使用されている。 </li></ol> 注：トリパンブルー色素排除法により細胞生存率分析は、生存率のわずかな減少を示した5時間後、室温でDEP緩衝液に懸濁し、早期MOSE（MOSE-E）は、細胞の（95.1から91.6パーセント）。これは、生存率のわずかな減少同様の細胞は、長期バッファDEPに格納されるべきでないことを示す、MOSE-L細胞について起こることが予測される。 <ol start="3"><li>このような酵素的に活性化カルセインAM、蛍光膜透過性色素を用いて細胞を染色。 </li><li>染め細胞懸濁液の導電率を測定します。導電率は、約100μS/ cmである必要があります。導電率測定が高すぎると、3×10 6細胞/ mlでDEP緩衝液中に再懸濁し、試料をスピンダウンし、導電率測定を繰り返す。 </li></ol> 3。のcDEPマイクロ流体チップのロード<ol><li> 30分間真空下でのマイクロ流体チップを置きます。 </li><li>一方、マイクロ流体チップが配置される顕微鏡のステージにシリンジポンプからの距離をまたがるようにフレキシブルチューブの部分をカット。ここで、チューブの6インチの長さ必要とされている。注射器の先端を針にフィットチューブ。 </li><li>チューブの断面積で目標収集されたサンプルボリュームを分割して出口管に必要な長さを推定する。ザ·チューブの長さを必要とするカット。 </li><li>シリンジ内に細胞懸濁液を描画します。気泡がチューブ又はシリンジ内に配置されていないことを確認してください。 </li><li>真空からチップを取り外す際に、チャンネルに閉じ込められた空気の泡を避けるために、すぐに出口チューブとプライムサンプルチャネルを挿入します。それはバリアが破裂することなく5ミリリットル/時のほぼ一定の高スループットに耐えられることが観察されているものの、（20ミクロン）の薄い絶縁バリアを破壊を避けるために、プライミング時に優しく、注射器をタップします。 </li><li>プライム電極チャネルに、迅速に、各流体電極チャネルの1コンセントに空のピペットチップを配置します。ローダミンBを少量含有する200μlのPBSをピペットで穏やかに電極チャネルの反対側の端部に流体を導入するためにタップする。穏やかな圧力を維持するローダミンBを含むPBSまで目に見えて、空のピペットチップの先端を進む。各電極のチャネルに対して繰り返します。ローダミンBのみ蛍光流体の電極チャンネルを視覚化するために使用される。 </li><li>ピペットチップ貯水池内の気泡形成を避け、ゆっくりと上下にピペッティングすることにより、目に見える気泡を除去ローダミンBとPBSで各ピペットチップリザーバーを満たし、プライミング後に。アウトレットチューブを外し、ターゲットボリュームを収集するために、新鮮な出口チューブ容器を挿入した後、適切に廃棄します。 </li></ol> 4。のcDEPチップを用いて細胞の特徴クロスオーバー周波数<ol><li>デジタルカメラ（ 図4）を備えた倒立顕微鏡のステージ上のチップを置きます。 </li></ol><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4.jpg" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg"/> 図4。 </stroNG&gt;（A）のcDEP実験のための全体的な実験。のcDEPチップは、倒立顕微鏡の台上に配置されている。カメラは、記録のためにパソコンに画像を送信します。シリンジポンプは、一定の入口流れを維持する。関数発生器は、高電圧増幅器で昇圧し、ワイヤ電極のcDEPによりチップに接続された信号を生成する。オシロスコープは、チップに送られる信号を監視している。（B）のcDEPチップと流体と電子接続の詳細ビュー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig4highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <ol start="2"><li>シリンジポンプにシリンジをマウントし、流体電極チャネル貯水池にワイヤ電極を挿入します。 </li><li>シリンジポンプとシリンジとの間の良好な接触を確保するためには1ml /時間でを通して流体をポンピング。視覚的に妨げられない細胞のフロー及び気泡または漏れがないことを確実にするために、チャネル長を検査する。レッド0.005ミリリットル/時UCE流量。 注意：1ミリリットル/時の31,35と高いスループットが他の形状のデバイスで実現しています。 </li><li>安全のために、関数発生器、高電圧アンプ、オシロスコープの電源をオンにし、所望の電圧と周波数を調整することにより、電子機器をテストします。ここで、これらのパラメータは、200 Vおよび20 kHzのです。許容可能なパフォーマンス、電源オフの検証時に。高電圧アンプに電極を接続します。 注：これらの実験に使用される高電圧での電子機器を操作するときに適切な電気安全手順に従ってください。 </li><li>定常流を達成すると、所望の周波数で所望の電圧を印加する。この実験では、電圧は5〜60 kHzの間の周波数で200 V RMSです。 </li><li>チャネル内の細胞分布を定量化するためのクロスオーバー周波数を特徴付けるために画像処理技術（ステップ5）を有する細胞応答の記録ビデオファイル。これを行うには、一定の電圧を維持し、体系的に周波数を変える。実験の開始時と終了時と同様に、ランダムに実験ランの間に、任意の電界を印加することなく、細胞の分布をコントロール細胞分布を記録する。 （ここでは5分）監視対象の場所に入口から流入するセルに必要な時間の量を推定する。この時間を待って、新しい周波数を設定した後、それから（ここでは、細胞分布の2分のビデオ）を記録を開始。 </li></ol> 5。特徴分析クロスオーバー周波数のための画像処理<ol><li>計算スクリプトを使用して、相対的なy位置を決定するために、フレーム毎のビデオフレームを分析する（z方向は、チャネルの垂直深さであり、y方向はチャネル幅であり、x方向、チャネル長）の各蛍光細胞または粒子のダウンストリーム·チャネル、高誘電泳動力の領域から、x座標が指定されました。相対DISのグラフを作成します。tribution。 </li><li>コントロール分布の中心線と各電圧と周波数の分布の中心線を比較してください。与えられた電圧と様々な周波数では、中心線がコントロールのy位置と一致するクロスオーバー周波数を決定する。 </li></ol> 6。細胞選別または濃縮を行うために実験を変化<ol><li> 3×10 6粒子/ mlの総濃度でDEPバッファ内の所望の混合物を一時停止します。ここでは、この混合物をDEPバッファ内の4ミクロンの蛍光ビーズとMOSE-L細胞である。のcDEP素子を作製するために、前述の手順を実行します。 </li><li>混合物からの細胞を選別または濃縮するために、前述したように、標的細胞とのバックグラウンド粒子のクロスオーバー周波数を決定する。粒子の二つの集団が反対の（d）にDEP力を受けるように、標的細胞とのバックグラウンド粒子を2クロスオーバー周波数の間の周波数で動作する実験irections。 MOSE-L細胞と4μmのビーズを並べ替えるには、11.90±0.63 kHzを超えるマイクロデバイスを操作してください。最近Salmanzadeh ら 33により報告MOSE-L細胞の第一のクロスオーバー周波数</li><li>ソートされたサンプルの内容を収集するために、出口開口部にグローブの指を置き、ゆっくりとチューブに引っ張ることで、ターゲットボリュームを集める際に出口チューブを外します。さらなる分析のために貯水池に集め、ターゲットボリュームを注ぐ注：他のサンプル回収方法は、チップへの恒久的な貯蔵器を取り付け、簡単なピペッティングして、サンプルを除去することを含む可能性があります。 </li></ol>

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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+concentration+of+human+cancer+cells+using+contactless+dielectrophoresis.">Selective concentration of human cancer cells using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2523-2529 (2011).</li><li>Salmanzadeh, A., Shafiee, H., Davalos, R. V., Stremler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+mixing+using+contactless+dielectrophoresis.">Microfluidic mixing using contactless dielectrophoresis.</a> Electrophoresis. 32, 2569-2578 (2011).</li></ol>

博士ラファエルDavalosは、非接触型誘電泳動のための特許を申請中。

DEPは、粒子の誘電特性を決定し、隔離、または濃縮アプリケーションを並べ替えるに向けて粒子運動を指示するための強力な手法です。原因サンプルと直接電極コンタクトの有害な影響に、他の人が接触しないように、以前に提示した方法と同様のアプローチをとっている。例えば、バシルら、薄いガラスカバースリップによりプリント回路基板電極から分離されたPDMSマイクロ流体デバイスを用いて非接触DEP装置を開発し、この技術は、ビデオフォーマットで利用可能にされる。23,36を ここでは、単一のPDMS基板を用いたのcDEPチップと前記流体の電極の製造、及び細胞および蛍光ビーズの混合物から卵巣癌細胞を分離するための実験プロトコルを示している。記載した技術は、正常LIVソーティングを含む、より複雑かつ生理学的に関連する種々の用途に使用されているeおよび死細胞、28腫瘍が前立腺癌細胞からの細胞、希赤血球から30の癌細胞、31,32を開始し、乳癌37および卵巣癌のステージを区別する。29のcDEPは、粒子を混合するために使用されている。38これらのアプリケーションが提示単純な技術を用いて、多様な目的は、チャネルの形状の設計を変更することによって簡単に達成することができることを示唆している。 。DEPは、粒子の操作のためのマイクロスケール上で有用である球状粒子のための13、並進誘電泳動力の大きさと粒子の電気的特性とその懸濁媒体だけでなく、乗 ​​電場の勾配によって異なります。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq1.jpg" /> εmは懸濁媒体の誘電率であり、rは半径である粒子、およびRC [K（ω）]クラウジウス-モソッティ（CM）因子の実数部である。 CM係数は懸濁媒体と比較して、粒子の相対的な分極率の尺度であり、誘電泳動力の方向を決定する。それは次のように記述されている<img alt="式2" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq2.jpg" /> どこ<img alt="式3" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq3.jpg" />と<img alt="式4" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq4.jpg" />粒子と媒体との複合体誘電率は、それぞれ、である。複素誘電率、 <img alt="式5" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq5.jpg" /> 、導電率（σ）と周波数（ω）に依存します。球状​​粒子のCMの係数は、理論的には-0.5と1との間で結合されている。 CM係数が負である場合には媒体は、粒子よりも分極性であるため、粒子が領域から離れるので、粒子はNDEPを体験高電界勾配。 CM係数が正である場合、粒子が媒体より分極​​可能であり、それらは高電界勾配の領域に向かって移動するPDEPを経験する。 細胞のような構造において不均一である生物学的粒子、例えば、クラウジウス - モソッティ因子は、粒子の誘電率の有効値から決定することができる。 <img alt="式6" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq6.jpg" /> どこ<img alt="式7" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq7.jpg" />と<img alt="式8" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq8.jpg" />それぞれ、例えば、細胞質、細胞内部の効果的な複素誘電率と、原形質膜の複素誘電率であり、rはセルの半径であり、dは、原形質膜の厚さである26。 DEPは中に浮遊する粒子を発生した場合流体は、流体に対する粒子の相対運動は、粒子上に抗力を発生する。粒子に作用する全体の力を決定するときに、この抗力を考慮しなければなりません。ここで興味のある状況では、粘性力が支配し、粒子が球状小さく、比較的低速度で移動すると仮定しているので、ストークス抗力法律は抗力のために良い近似を提供します。 <img alt="式9" src="/files/ftp_upload/50634/50634eq9.jpg" /> ηは流体の粘度であり、uはpは粒子の速度であり、u fはまた移動することができる流体の速度である。誘電泳動力、流体と粒子​​の特性を知られており、既知の流速が所定のドラグ力と誘電泳動力とのバランスは、粒子速度を推定するために解くことができる。細胞の経験が閾値以下である必要があり、せん断速度は、cでエル溶解が発生する可能性があります。 粒子の電気的性質の特徴付けは、彼らが、DEPの下でそれらをどのように応答するかを予測し、制御する必要がある。本研究では、特異的に細胞の第一クロスオーバー周波数を決定するためのプロトコルを示すためにMOSE-L細胞を用いた低周波のcDEPを利用し、その後、それらの対向DEP応答に基づいてポリスチレンビーズとMOSE-L細胞の連続的な選別を示した。 のcDEP装置の形状は、デバイスは、高周波数または低周波数動作のために設計することができるように、電場の空間勾配を変更し、高い選択性及び特定の細胞型のソートの効率を変化させるであろう。さらに、ハイスループットデバイスは、より広いチャネルを作製することによって開発することができ、並列、又は電極30内のチャネルは比較的深い垂直に上方および下方に積層された多層の製造35、30チャネルサンプルチャネル。薄い膜は、層の間に障壁を形成する。ポリメチルメタクリレート（PMMA）で製造されたデバイスおよびポリカーボネート（PC）膜を用いた予備試験はMOSE-L細胞のDEP応答を実証した。現在の努力は、多層の高スループットデバイスを絞り込み、最終的プラグ·アンド·プレイ·プラットフォームに向かって周辺システムを改善するために進行中である。提示され、基本的な実験手法から展開するには、デバイスのアプリケーションと仕様は、このような特性評価に対してソート、またはデバイスにサンプル貯水池や半自動化システムを追加するなどの特定の要求に適合するように調整することができる。

生物学的サンプル濃縮および粒子選別、その後の分析のためにしばしば必要である。1は例えば、体液から稀な細胞の単離は、癌の検出および個別化医療において重要な用途を有する。2,3最も一般的に使用される濃縮技術は、蛍光活性化細胞選別である（FACS 4）細胞を区別するために発現される表面マーカーに依存ソーティング（MACS）、磁気活性化細胞、5。他の戦略は、流体力学6または慣性7,8ソート、光ピンセット、9 acoustophoresis、10と誘電泳動が含まれています。11,12誘電泳動は、不均一な電場の存在下での偏光の粒子の動きである。13 DEPが使用されている並べ広い応用範囲、生存能力に基づいて細胞を選別するなど、2,14、15が細胞の生体電気特性を特徴付ける、16とこれは強力な技術であるが、課題が生じ得る。17,18繁体DEPは、電圧を印加し、不均一な電場を誘導するためにマイクロ流体チャネル内にパターン平面電極を利用する。細胞の生物物理学的特性の誘起変化に13 ING、等電極剥離、電解。絶縁体ベースの誘電泳動（IDEP）19 DC電場の不均一性を引き起こす構造をパターニングして絶縁汚損、電極層間剥離、及び電極フィールドの空間的な分解の課題に対処している。 IDEPを選択的に、生存および死亡細菌細胞を分離19は、細菌胞子を単離し、20およびDNAを操作し、他の用途のうち、21に使用されている。それは多くの場合、必要​​とされる高DC電圧の結果として発生する可能性があるため、ジュール加熱が困難な場合があります。これらの課題を改善するために、非接触DEPマイクロデバイスが開発されている。22-24 22で満たされた流体電極チャンネル付きの金属電極の交換です導電性の高いソリューションを提供します。これらの流体電極は、容量的にAC電圧を介してサンプル流路に薄い絶縁バリアを越えて結合されている。電極とのサンプルの接触を排除することは、電気分解やバブル形成、サンプル汚染、電極の剥離などのDEPベースの方法に関連する問題を軽減します。それは、サンプル中の細胞の生存率をサポートしているため、結果として、のcDEPは、生物学的サンプルのために特に便利です。重要なのは、のcDEPは、サンプル無菌性を維持することができます。チップは、細胞培養フード内で調製する​​ことができ、実験は、金属電極へのサンプルの接触を必要とするか、サンプルがenvironmeに開かれることを必要とせずに行うことができるNT。単純なリザーバは、滅菌サンプル回収を容易にするために、チップ出口に固定することができる。さらに、試料チャネルと同じ生体適合性ポリマー材料（PDMS）からの流体の電極の製造は、金属電極のカスタム·パターニング、製造に要する時間で発生した高いコストを削減し、初期のパターニングに特殊なクリーンルーム設備の必要性を制限する再利用可能なシリコンウェーハのスタンプ。 DEPによる粒子の移動は、粒子および媒体、ならびに電場の空間的変化の特性に依存する。粒子および周波数に依存する因子は、クラウジウス - モソッティ（CM）因子と呼ばれる、範囲-0.5〜1の値をとり、そしてDEP力の方向を決定する。 CM係数が正確にゼロとなる周波数は、クロスオーバー周波数と呼ばれる。これは、誘電泳動力が粒子とCM率変化サインを与えない点である。 S不活性固体マイクロスフェアのためイングルのクロスオーバー周波数が発生したときに負から正へのCM係数の変化は0.01 S / M、NDEPからPDEPが10近く存在への移行を示す第クロスオーバー周波数程度の低い導電率·バッファ内の哺乳動物細胞に25。 - 100 kHzおよびサイズ、形状、細胞骨格、および細胞の膜特性に影響される。26,27 NDEP体制に対するPDEPからのシフトにおける第クロスオーバー周波数は、10MHzのオーダーであり、によって影響される核-細胞質比、細胞質導電率、および小胞体27 DEP力は、流体流の存在なしに適用することができるが、ここでは懸濁粒子の連続的な選別を達成するために、流れる流体を利用する。誘電泳動力とストークス抗力を合わせた影響は、粒子の並進運動を指示する。 我々は2つ​​の周波数範囲で動作する装置を開発した。高い周波数yのデバイス（100〜600 kHzの）は、前立腺腫瘍開始細胞（TICを）、マウスの卵巣表面上皮（MOSE）細胞、MDA-MB-231乳癌細胞として、PDEPおよび細胞の達成バッチソーティングを用いて操作、又はTHPの生きている-1選択的にサンプルチャネル内に配置ポストを絶縁に目的の細胞を捕捉することで細胞が28〜31低い周波数（5から100 kHzの）デバイスが連続的に動作し、1集団がバックグラウンドの人口の経験ながらPDEPを経験する頻度動作時NDEPは、ソーティング達成するために、粒子軌道をリダイレクトすることができる。32-34これらの低周波デバイスは、赤血球からの癌細胞をソートプログレッシブMOSE細胞株の誘電特性の変化を決定し、非影響を解明するために使用されてきた攻撃的なMOSE細胞の攻撃的な特性を逆にするに有毒スフィンゴ脂質の治療。さらに、マイクロデバイスのcDEPは、現在までを1ml /時間、スループットの向上で動作するように設計することができるR。31,35 上述したように、製造プロセスの柔軟性および低コストが提示されている実験手順は、広範囲の用途に関連することを可能にカスタム設計されたデバイスの幾何学的形状を可能にする。のcDEPの長期的な目標は、その後の培養や処理のサンプルの回収と、臨床レベルでのラベルフリー細胞選別および濃縮を実現することである。ここで紹介するテクニックは、DEPのアクセス可能性を増加させる、製作から実験を、簡単で安価な方法です。我々は、特徴付けおよび蛍光マイクロスフェアからの卵巣癌細胞の濃縮を達成するためのcDEPチップの調製および実験プロトコルを示す。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI,USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>The Microscope Depot</td>
			<td>76079</td>
			<td>2x3 inch-ground edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co, Vernon Hills, IL, USA</td>
			<td>EW-06417-31</td>
			<td>Thin walled 20 gauge, 0.032"ID x 0.056"OD, 100 ft/roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-slip plastic syringes</td>
			<td>National Scientific company</td>
			<td>S7510-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle tip</td>
			<td>Howard Electronic instruments</td>
			<td>JG20-1.0</td>
			<td>20 Gauge 1.0", ID=0.025" OD=0.036"</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td>
			<td>S3-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose, reagent ACS, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics N.V., Fair Lawn, NJ</td>
			<td>AC410955000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Quality Biological Inc.</td>
			<td>112-025-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM, Molecular Probes</td>
			<td>Invitrogen Corp. (life technologies), Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>excitation wavelength 488/emission wavelength 516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine B, O</td>
			<td>Science Lab</td>
			<td>SLR1465-100G</td>
			<td>excitation wavelength 540/emission wavelength 625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (10X)</td>
			<td>Gbiosciences, St. Louis, MO</td>
			<td>RC-147</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica, inverted light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DMI 6000B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC420, color camera</td>
			<td>Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA</td>
			<td>Leica DFC420</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function generator</td>
			<td>GW Instek, Taipei, Taiwan</td>
			<td>GFG-3015</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wideband power amplifier</td>
			<td>Amp-Line Corp., Oakland Gardens, NY, USA</td>
			<td>AL-50HF-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFHV Output Transformer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>AL-T50-V25/300-F100K-600K</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage amplifier</td>
			<td>Trek</td>
			<td>Model 2205</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Modular Oscilloscope, 100 MHz</td>
			<td>AgilentTechnologies</td>
			<td>U2701A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expanded Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001/002 (115/230V)</td>
			<td>air plasma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Magic tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>any available width is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>Z708836-25EA</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres Sulfate Microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8858</td>
			<td>4.0 &mu;m, red fluorescent (excitation wavelength 580/emission wavelength 605)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 9260 photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 400 K developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) 25%</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>provided by Virginia Tech cleanroom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon coating</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>applied using DRIE machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td>100 mm diameter, 500 &mu;m thickness, one side polished (SSP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Reactive Ion Etching (DRIE)</td>
			<td>Alcatrel</td>
			<td>AMS SDE 100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free isolation and enrichment of cells through contactless dielectrophoresis

誘電泳動（DEP）は、不均一な電場中の粒子が並進運動を偏光していることにより現象であり、表面マーカーに依存しない方法で微粒子の動きを指示するために使用することができる。伝統的に、DEP装置は、サンプルチャネルにパターニング面状の金属電極を含む。このアプローチは、高価であり、特殊なクリーンルーム環境を必要とすることができる。最近では、非接触型誘電泳動（のcDEP）と呼ばれる非接触のアプローチが開発されている。この方法は、単一のポリジメチルシロキサン（PDMS）基板からの流体の電極とサンプル流路をパターニングして、電極と試料との間の直接接触を回避しながらDEPの古典的な原理を利用し、微粒子をソートし、濃縮するために設計された迅速なマイクロ流体戦略としての用途を有する。この方法に固有の分離された高導電性流体を含む流体の電極チャネルを介して電界が生成されることである薄い絶縁バリアによってサンプルチャネル。金属電極を直接試料に接触しないので、電気分解、電極層間剥離、および試料汚染は回避される。さらに、これは、安価で簡単な製造プロセスを可能にする。 のcDEP従って、敏感な生物学的粒子を操作するために適している。粒子に作用する誘電泳動力は、装置の幾何学的形状のカスタマイズ可能な設計により発生する電界の空間的変化が、細胞の固有の生物物理学的特性に依存するだけでなく依存する。このように、のcDEPはまだ生体粒子の特性、濃縮、および並べ替えを可能にしながら可変、集団内で発現させることができる表面発現分子バイオマーカーに応じて、回避ラベルフリー技術です。 ここでは、のcDEPを使用して製作し、実験の基本を示しています。我々はソフトリトグラフを使用してのcDEPチップの簡単な準備を説明Yテクニック。我々は、粒子または細胞のクロスオーバー周波数、誘電泳動力がゼロとなる周波数を特徴付けるための実験手順について述べる。最後に、我々は、卵巣癌細胞の混合物を選別し、微小球（ビーズ）蛍光を発するためのこの技術の使用を示す。

DEPは、電界が存在しているときにデバイスが動作しているを確認するためにサンプルチャネルで定性的に観察されるべきである。 DEPの存在をテストする1つの方法は、はるかに強力なPDEPとNDEPが予測され、クロスオーバー周波数PDEPとInほとんどの哺乳動物の癌細胞のためにNDEPを観察する&lt;10 kHzのを観察する（およそ&gt; 40 kHzのからの値に周波数を調整することです）100μS/ cmの導電率のバッファ。それは、不活性微小球がそのクロスオーバー周波数より上、そのクロスオーバー周波数以下PDEPを示し、NDEPことに留意すべきである。ここで紹介するノコギリフィーチャジオメトリの場合は、PDEPは低い試験周波数にいる間、NDEP、パールチェーン化とチャンネルのノコギリの特徴エッジでの細胞または粒子の集束の発生によって示される、高いテスト周波数でセルに見られるべきである細胞は、チャネルのストレートエッジにより近い領域に制限されるように明らかなはずである。これらの低周波数では、細胞は、Lysよい原因エレクトロポレーションへのEので、サンプルが少ない細胞を含むように表示されることがあり、酵素的に活性化蛍光色素を用いた場合に表示されているものが拡大、ぼやけて表示されることがあります。 PDEPおよびNDEPが発生する周波数の確認プロトコルに記載のようにクロスオーバー周波数を決定することができる。ここで用いられるようなMOSE-Lなどの哺乳動物の癌細胞に関しては、60 kHzの（ 図5b）で5 kHzの（ 図5a）と強いPDEPでNDEPを観察した。 MOSE-L細胞は17.7±3.3であった（n = 268セル）の直径を有し、ビーズを4ミクロンの公称直径を有する。進行の早い段階でMOSE細胞と比較してMOSE-L細胞の誘電特性の完全な分析はSalmanzadeh らによる最近の研究で見つけることができます。33 PDEPとNDEPはこれらの両極端で観察されていない場合は、様々な問題が発生している可能性があります。試料の導電率は、汚染物または細胞溶解に対して高すぎる可能性があります。 Insufficientの電界は、サンプルチャネルに隣接するチャネルの部分への電流の伝導を防止する流体の電極チャネルに捕捉された気泡を生成することができる。非定常流に起因する不十分貼りPDMSの離層に、注射器または入口管にトラップされたバブルに起因する十分な時間、真空下でデバイスを保っていないか、すぐに真空から除去する際に、デバイスを充填しないから生じる気泡漏れすることがありポンプの動作範囲の極値でチャネルを充填し、又は流量時、スライドガラス、過度の力に対するバリア膜中の涙が加わる。 細胞のクロスオーバー周波数を決定することに加えて、この技術は、MOSE-L細胞およびビーズの混合物によってここでは図示混合物を、ソートするために使用することができる。この例では、MOSE-L細胞は、正の誘電泳動（PDEP）を経験周波数で4μmのビーズが示す負の誘電泳動（NDEP）を利用しています。我々O200 V RMSおよび10 kHzの（図6a）でデバイスをperated、それらがNDEPを経験したように、細胞およびビーズの両方を混合したことを観察した。ビーズを二つの成分（ 図6b）に混合物の分離を可能に、チャネルの下側部分に制限している間50 kHzで、我々は、チャネルの上部にMOSE-L細胞の動きを観察した。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg"/> 図5。 MOSE-L細胞の位置は、印加電界の周波数を変化させることにより操作される。写真はサンプルチャネルの最終鋸歯特徴で採取され、流体電極は右側の隅に位置している。それらは、PBSチャンネルを可視化する蛍光を発するローダミンBを含有する充填されている。（a）の MOSE-L細胞は200 V RMSでNDEPを体験<html>と5 kHzの。（B）MOSE-L細胞は、200 V RMS、60 kHzで真珠のチェーン化とPDEPを体験。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50634/50634fig5highres.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50634/50634fig6highres.jpg"/> 図6。 MOSE-L細胞（緑色）および4ミクロンビーズ（赤色）の混合物を 200 Vで（a）の低周波のcDEP装置のサンプル流路の最終鋸歯状の特徴を通って流れ 、10kHzの細胞およびビーズを混合する。矢印は、200 Vで（B）。かすかに可能性が高いため、低周波条件に死亡した細胞を登場をポイントし、50 kHzの細胞がPDEPを体験し、チャネルの特徴エッジに移動し、ビーズがNDEPを体験しながら、地域のより近くに閉じ込められたままストレートエッジ。p_upload/50634/50634fig6highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

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Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

非接触誘電泳動（のcDEP）は、それらの本来の誘電特性を経由して、ソートや粒子の濃縮実現しています。流体電極チャネルは、生物学的粒子の非損傷性の滅菌特性評価およびソートするのcDEPを作動特性、DEPに伝統的な金属電極を交換してください。私たちは、のcDEPのマイクロデバイスを準備し、セルのキャラクタとソート実験を行う方法を示しています。

非接触型誘電泳動によりラベルフリーの単離と細胞の濃縮

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

label-free-isolation-enrichment-cells-through-contactless

Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K ビュー.  Virginia Tech. 非接触誘電泳動（のcDEP）は、それらの本来の誘電特性を経由して、ソートや粒子の濃縮実現しています。流体電極チャネルは、生物学的粒子の非損傷性の滅菌特性評価およびソートするのcDEPを作動特性、DEPに伝統的な金属電極を交換してください。私たちは、のcDEPのマイクロデバイスを準備し、セルのキャラクタとソート実験を行う方法を示していま?...

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

医学

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

ヒト細胞株から化学療法抵抗性の卵巣がん幹細胞の濃縮

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

卵巣がんの腫瘍開始細胞の体外富化

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

マウス癌モデルからの循環腫瘍細胞の単離と伝播

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

腫瘍特異的内皮細胞の単離および培養拡大

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

ミニブタの滑液および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および細胞表現型

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

犬の動脈と静脈からの初代内皮細胞の単離および培養

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...