著者は、元PB1996クローンするための有用な議論と技術的なアドバイスのためのピーター·ルーベンスタイン、デビッドPellmanに感謝します。この作品は、ダイムの月からの助成金や子供のためのライドからの資金によって支えられている。

1。PB1996プラスミドへのクローニング<ol><li>デザインと注文DNA標的配列に隣接し、選択した親プラスミド中のユニークな制限部位を含むオリゴヌクレオチド製造会社からのプライマー。注：この場合、プライマーは、AIP1配列の5 &#39;末端に400塩基対を増幅するように設計した。 XhoI制限部位は、約20bpのAIP1配列の前にプライマーに組み込んだ、とXmaI AIP1は、標的配列の後に約20塩基対を含めた。クローニングに用いたプラスミドは、蛍光用3XGFPタグ、酵母株選択のためのURA遺伝子、および細菌選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を含むPB1996であった。 </li><li>裏酵母一倍体株からゲノムDNAを精製する。注：クローン作成プロセスの図については図1を参照してください。 </li><li>いずれかの専用の制限部位とAip1p遺伝子を増幅するために二つのプライマーおよび酵母ゲノムDNAを用いた標準的なPCR反応を実行D。推奨されるプロトコルをメーカーごとに別々の反応において制限酵素でPCR産物およびPB1996プラスミドを消化する。この場合のXmaIおよびXhoIで1時間37℃で添付の緩衝液で使用した。 </li><li>消化されたDNA断片を分離するために、0.8％アガロースゲル電気泳動を実行する。 1ウェル内に、低いDNA質量ラダーをロードして、別々のウェルに、各々の消化から全反応をロードします。色素の先端がゲルの終わり近くになるまで、約1時間、100ボルトでゲルを実行します。 UV光下でゲルを視覚化し、タンパク質のセグメントに対応するセグメントと切断プラスミドを精製した。 </li><li>消化AIP1セグメントとPB1996プラスミドを連結。製造元のプロトコルを用いてDH5α細胞中に製品を変換（2分間42℃で、氷、熱ショックで30分間、100μlの細胞を有する10μlのDNA、37℃で2時間SOC培地中で増殖）と、培養プレート上にプレートつまり、この場合のLB +で、選択のための抗生物質を含んでAmpプレート。液体培養で1コロニーを選択し、成長する。新たに設計されたプラスミドを精製する。 </li></ol> 2。変異酵母株の生成<ol><li>アクチン対立遺伝子変異酵母株を構築するために削除された半数体酵母株を使用してください。注意：この株は染色体アクチン遺伝子を欠いており、野生型酵母をコードするプラスミドが含まれているこの場合、親株は、ピーター·ルーベンスタイン（アイオワ大学）からの寛大な贈り物だったと建設はCook ら 20により記述されていた。アクチンとウラシル。 </li><li>突然変異誘発の21のベースプラスミドとしてのTrp +選択とのPRSコードするプラスミド野生型酵母のアクチンを使用してください。 </li><li>アクチンにミスセンス変異を設計するのPRSプラスミド上の部位特異的突然変異誘発を行う。 <ol><li>アクチンにおけるR256H変異について、彼の256のArg 256を変更するために、プライマー5 &#39;ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3」を作る。標準の突然変異誘発を実行ステップ2.2からのプラスミドを用いたPCR反応。 </li><li> DH5α細胞中にPCRから、変異アクチンプラスミドを変換します。プラスミドDNAを単離し、変異を確認するために、アクチン遺伝子を配列決定する。 </li></ol></li><li>ステップ2.1からの半数体酵母株に変異酵母のアクチンをコードするプラスミドを変換します。 </li><li>文化TRP-プレート上の形質転換細胞は変異酵母アクチンプラスミドを含むのTrp +を含む酵母を選択した。 </li><li> 5 - フル酸（5-FOA）を含有するプレート上TRP-プレートから継代培養細胞による野生型アクチンと（2.1で説明）ウラシルをエンコードし、元のプラスミドを欠いた細胞を選択する。 5-FOAは、機能的URA3遺伝子を発現賛否株で、毒性型、5 - フルオロウラシルに変換される。段階的に選択した後に成長した細胞のみが、変異アクチンプラスミドが含まれています。 </li><li>新しい酵母株からのプラスミドDNAを精製する。アクチン遺伝子変異体が存在する保証するために、プラスミドを配列決定。このS使用さらなる研究で訓練。このプロセスを図2に図解されている。 </li></ol> 3。酵母細胞にプラスミドの変換<ol><li>酵母染色体への組込みを可能にする制限酵素でAip1p-GFPプラスミドを消化する。 NOTE：制限部位は、蛍光タグ、目的の遺伝子、および選択マーカーを含むシーケンスブロックの外でなければならない。この場合、37℃で8μlのDNAを、1時間に伴う10倍の緩衝液1μlでのHpaI制限酵素の1μlを使用する</li><li>文化S. 30℃でのホイールのYPD培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％デキストロース）中の5mlの一晩ウラシル（裏株）を合成することができない（工程2.5からの） セレビシエ細胞千X gでダウン5分間の細胞の1ミリリットルを紡ぐ。 </li><li>プレートの混合物を作る。のddH 2 Oで43 mlの1 MトリスpH7.5、5mlの250mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）2 mlを添加することにより10XTEを作る0を追加20mlの1XTEに酢酸リチウムの0.204グラム、次いで8ポリエチレングリコール（PEG）（MW〜3,300）のg及びフィルター滅菌し。 </li><li>ステップ3.2でスピンダウンした細胞から上清を除去し、残りの液体中の細胞を懸濁します。懸濁した細胞を、10 mg / mlのサケの精巣キャリアーDNAの2を添加する。ステップ3.1渦から消化したプラスミドDNAの10を添加する。プレートと渦の0.5ミリリットルを追加します。 1 M DTTおよび渦の20を添加する。 </li><li> 25℃で6〜8時間にわたって混合物をインキュベート熱は、10分間42℃の水浴中の細胞に衝撃を与える。彼らは、裏板に沈降してきたマイクロ遠心管の底部からの細胞のプレートを100μl。 2〜3日間、またはコロニーが形成されるまで30℃で培養する。 </li><li>外裏板に個々のコロニーと連勝を選択します。注：これらの細胞は、成長を考慮して、染色体に組み込まAIP1-GFPおよび裏遺伝子を有するプラスミドを含んでいる。次いで、これらの細胞をmicroscoで使用されるPY。 </li></ol> 4。全反射蛍光顕微鏡を用いてAip1pタンパク質運動の可視化<ol><li> 30℃で一晩ホイールにYPD中で組み込まAip1p-GFPで酵母細​​胞の培養を育てる9ミリリットルの浦のメディアへのサブカルチャー一晩培養物1ミリリットルを。それらが対数増殖期にあることを確実にするために、30℃でシェーカー上でさらに3〜4時間、細胞を増殖させる。 </li><li>ガラス顕微鏡スライドに細胞の3μLを加え、カバースリップを追加します。細胞は5分間スライドに解決することができます。ステージプレートの金具でスライドを置きます。 </li><li>客観的な油浸100X TIRFとデジタルCCDカメラを用いて全反射蛍光（TIRF）顕微鏡（488ナノメートル）でAip1p-GFPタンパク質を観察します。 SlideBook 5.0ソフトウェアを使用して、（取得された画像の個々のフレームは、 図2Aに示されている）5コマ/秒の速度で20秒間の画像を得る。 <ol><li> Cに集中するのエル、オープンSlideBook 5.0ソフトウェアとフォーカスコントロールにアクセスするには、ツールバーにフォーカスウィンドウのボタンをクリックします。 [スコープ]タブを選択し、100X-TIRF目的を選択します。上のランプの電源を入れ、15％、ランプバーをスライドさせます。 2×2にビンの設定を変更します。明視野にフィルタを変更してください。 </li><li>顕微鏡、コンピュータの画面上で見られるように焦点に細胞を持って来るためにファインフォーカスダイヤルを使用しています。 </li><li>ランプをオフにし、フォーカスウィンドウ内のコントロールを使用して、ライブフィルタを変更し、TIRFM]ボタンをクリックします。 </li><li>顕微鏡の右側ポートに接続されたTIRFM照明に、Onにレーザ発光を回す。 </li><li>フォーカスウィンドウ内のストリーム]タブを選択し、録音を開始してから、明視野]ボタンをクリックして次のチェックボックスをオンにします。 </li><li> TIRFM照明に、レーザーの入射角を調整するマイクロメータを回す。これは、AIP1-GFP病巣からの蛍光発光を最適化し、バックグラウンド蛍光を最小化するために使用される細胞とスライド。 </li><li>所望の画像が表示されたら、[スタート]を押し​​ます。 20秒後、停止ボタンをクリックします。画像を保存します。メインメニューバーの[ファイル]タブの下で、名前を付けて保存するスライドを選択し、ファイルの場所と名前を入力します。 </li></ol></li><li>画像を分析するためにImageJソフトウェアを使用してください。蛍光Aip1p病巣の動きとレートを追跡するために、マクロプラ​​グイン「手動トラッカー」を使用してください。 0.2秒の時間間隔のパラメータを変更します。 <ol><li>追加トラックの選択を使用して、四から八結合フレームを通じて、個々の蛍光タンパク質を選択し、追跡します。終了トラックコマンドを使用して、各フレーム間のタンパク質の動きの速度が結果ウィンドウに表示されます。 </li><li> Microsoft Excelスプレッドシートを使用して、各フレーム間の平均速度を決定する。目的の各細胞株のためのAip1p運動の平均速度を計算するための値を使用します。 NOTE：Aip1p運動の速度および平均非線速度の散布図は、 ふぃぎゅに示されている図2（b）再。 </li></ol></li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+effects+of+thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection+alpha-smooth+muscle+actin+mutations+on+actin+function.">Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function.</a> J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

病原性の変異による検査において細胞骨格と実用性のダイナミクスを可視化するための効果的な戦略は、ここに記載されている。高度な画像診断法は、細胞膜の近くにタンパク質の細胞内の動きを理解するための新しい機会を作成しました。全反射蛍光顕微鏡（TIRF）は、生きた細胞内の機能研究のための高感度の技法である。 TIRFはカバーガラスと、水性媒体の屈折率の差によるエバネッセ?...

アクチンは細胞骨格を構成する支配的なタンパク質であり、細胞分裂、細胞小器官の動き、細胞の運動性、収縮、およびシグナリングを含む重要な細胞プロセスに参加しています。過去10年間で、アクチンにおける疾患の原因となる変異は、筋障害の冠動脈疾患1-7に、障害の範囲につながる6ヒトアクチンアイソフォームの各々で発見されました。アクチン変異が疾患につながるそれによってプロセスが解明され続けています。酵母モデルは、単一の本質的なアクチンアイソフォーム、遺伝従順とアクチン配列及び機能の高い保存性の利点により、アクチン機能の変​​異の生化学的効果を研究するためのゴールドスタンダードのまま。研究では、個々のアクチン変異がドミナントネガティブ効果8との分子の特定の機能不全につながることを示している。たとえば、のLys-118残基に影響を与え、γ-非筋アクチンにおける難聴の原因となる変異はによって規制を変えるアクチン結合タンパク質ARP2 / 3 9。研究は、しばしば、インビトロで用いるタンパク質の分析：タンパク質相互作用。細胞中のタンパク質の局在化結合細胞生物学上のアクチン変異の効果の調査、特に、アクチンは限られている。 生体内での酵母細胞骨格の研究では、従来、倒立蛍光顕微鏡10からの固定された細胞の画像に依存しています。これらの実験は、アクチン細胞骨格の形態学についての基礎的なデータを提供しました。調査は複雑なので、細胞骨格網11,12を可視化する三次元共焦点イメージングを組み込んでいる。この撮影は、豊かさとアクチンパッチやフィラメントの相対的な位置の定量化を可能にします。薄いセクションの電子線トモグラフィーは保存細胞内構造13と比較して密な線維状のネットワークの形態画像に使用されてきた。混雑した携帯S小断面のペースは、この技術を用いて微粒子を詳細に調べることができる。イメージング研究は、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて生細胞に拡張されている。光退色およびバックグラウンド蛍光を緩和することができる場合には、タイムラプスイメージングは、細胞骨格タンパク質の動力学および環境条件11,14に対する応答として調べることができる。これとは別に、 インビトロでのアクチンフィラメントのダイナミクスの可視化は、全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡法を導入することにより進めた。広視野顕微鏡法と比較して、TIRFが減少バックグラウンド蛍光と個々のフィラメント15,16を監視するための造影という利点を有する。これらの特性により、TIRF顕微鏡法は、原形質膜17,18で細胞構造を監視するために、細胞生物学者によって適合されている。細胞骨格の変化を含む細胞事象、、することができます低光毒性、最大コントラスト、最小のバックグラウンド蛍光19でリアルタイムに可視化すること。 より良いセル、全反射顕微鏡およびタンパク質のタグ付けに動き、ローカリゼーション、および細胞骨格タンパク質のターンオーバーにアクチン変異の影響を理解するために使用された。ここで、 サッカロミセス·セレビシエにおける細胞骨格アクチン動態における臨床的に関連する突然変異の効果を研究するための方法が記載されている。具体的には、アクチン結合タンパク質、Aip1pの局在化および運動は、アクチンにおけるR256H変異を発現する細胞中で可視化し、定量した。これらの技術は、in vitro生化学的研究で補完し、タンパク質相互作用や機能をより深く理解することを可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<colgroup>
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:103px;">rpi</td>
			<td style="width:119px;">9012-36-6</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:103px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:103px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td style="width:103px;">USB Corporation</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4166059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:103px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNA, single stranded from salmon testes</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">9007-49-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA pH 7.4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">93302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15585-011</td>
			<td>Warning! Harmful irritation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fungal/Bacterial DNA Kit</td>
			<td style="width:103px;">Symo Research</td>
			<td style="width:119px;">D6005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HpaI</td>
			<td style="width:103px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0105S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lithium Acetate</td>
			<td style="width:103px;">AlfaAesar</td>
			<td style="width:119px;">6108-17-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low DNA Mass Ladder</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10068-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NE Buffer #4</td>
			<td style="width:103px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B7004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12532-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Miniprep Kit</td>
			<td style="width:103px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27106</td>
			<td>Any kit will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Ligation Kit</td>
			<td style="width:103px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M2200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG</td>
			<td style="width:103px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">25322-68-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris Base Ultrapure</td>
			<td style="width:103px;">rpi</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td>
			<td style="width:103px;">Promega</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1/6/2015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XhoI</td>
			<td style="width:103px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XmaI</td>
			<td style="width:103px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0180S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">YPD media</td>
			<td style="width:103px;">LabExpress</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">-URA Media</td>
			<td style="width:103px;">LabExpress</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR Machine</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4359659</td>
			<td>Any PCR machine will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TIRF Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Olympus IX81</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hamamatsu ORCA-R camera</td>
			<td style="width:103px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aip1p dynamics are altered by the r256h mutation in actin

アクチンの変異は、多くの場合、細胞骨格の機能を変更する特定の分子変化によるヒト疾患の範囲を引き起こす。本研究では、全内部蛍光を用いて、蛍光タグ化タンパク質のイメージングは​​（TIRF）顕微鏡法は、細胞骨格の力学の変化を視覚化し、定量化するために使用される。 TIRF顕微鏡および蛍光タグの使用はまた、アクチンの突然変異によって引き起こされる細胞骨格の力学の変化の定量化を可能にする。この技術を用いて、生細胞中の細胞骨格機能の定量化は、常に時代のタンパク質機能のインビトロ研究で補完する。一例として、アクチン残基R256に影響するミスセンス変異は、このアミノ酸は、相互作用の調節に重要な役割を果たしている示唆して3つのヒトアクチンアイソフォームが同定されている。細胞骨格アクチンの運動に突然変異R256Hの効果は酵母モデルを用いて検討した。アクチン脱重合にコフィリンを補助することが知られているタンパク質、AIP1があったN-末端緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識しTIRF顕微鏡法を用いてインビボで追跡した。野生型および変異株の両方でAip1pの移動速度を定量化した。 R256H変異型アクチンを発現する細胞では、Aip1p運動は制限され、移動速度が1.60に比べR256H細胞で0.88±0.30ミクロン/秒（野生型細胞で測定されたほぼ半分の速度では±0.42、野生型細胞ではミクロン/秒、P &lt;0.005）。

画像への方法は、細胞内の細胞骨格タンパク質のダイナミクスを提示されている。アクチン結合タンパク質、Aip1pは、GFPでタグ付けされた。タグ付けされた生成物をコードするプラスミドのデザインを図1に示す。プラスミドは、次いで酵母細胞に形質転換した。蛍光の発現はAip1p、細胞内でのタンパク質の挙動の可視化を可能にしたタグ付けされた。 Aip1pは、一般的にエンドサイ...

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Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

アクチンにおける疾患の原因となる変異は、細胞骨格の機能を変更することができます。細胞骨格の動力学は、全内部蛍光顕微鏡を用いて蛍光タグ化タンパク質の画像化を介して定量化される。一例として、細胞骨格タンパク質、Aip1pは、変異アクチンアイソフォーム、R256Hを発現する細胞に局在化および運動を変更した。

Aip1pダイナミクスはアクチンにおけるR256H変異によって変更される

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

aip1p-dynamics-are-altered-by-the-r256h-mutation-in-actin

Research

JoVE Journal

Biology

7.9K ビュー.  University of Iowa. アクチンにおける疾患の原因となる変異は、細胞骨格の機能を変更することができます。細胞骨格の動力学は、全内部蛍光顕微鏡を用いて蛍光タグ化タンパク質の画像化を介して定量化される。一例として、細胞骨格タンパク質、Aip1pは、変異アクチンアイソフォーム、R256Hを発現する細胞に局在化および運動を変更した。 

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

生物学

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...