This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

社内ラテックス試薬の調製<ol><li>グリシン緩衝食塩水（GBS）の調製<ol><li> 1.5グラムのグリシン、11.7グラムの塩化ナトリウムおよび200mlのガラス製ビーカーに100mlの蒸留水を加える。 </li><li>マグネチックスターラーを用いて溶解するために混合する。 </li><li>メスシリンダー500mlに混合を移し、200ミリリットルの合計を作るために蒸留水を加える。 </li><li> 、200ミリリットルのビーカーに戻って解決策を移し、pHをチェックし、5M水酸化ナトリウムで8.2に調整してください。注：水酸化ナトリウムは腐食性で、個人用保護具を着用してください。 </li><li>フィルターは250ミリリットルpreautoclavedスクリューキャップ付きガラス瓶に、0.22μMのフィルターと複数の60ミリリットルの注射器を用いて溶液を滅菌する。 </li><li> RTで保管してください。 </li></ol></li><li> 0.2％ウシ血清アルブミンGBSの調製<ol><li> 200mlのガラスビーカーにウシ血清アルブミン（BSA）粉末を0.2g、およびGBS 100ミリリットルを加え、マグネチックスターラーを用いて溶解するために混合する。 </li><li>フィルター250ミリリットルpreautoclavedスクリューキャップ付きガラス瓶に、いくつかの60ミリリットルの注射器を使用して、0.22μMのフィルターを通して溶液を滅菌する。 </li><li> 4℃で保存。 </li></ol></li><li>ラテックス試薬調製<ol><li> 2ミリリットルの丸底マイクロチューブにラベルを付けます。 注：丸底チューブは、抗体の付着に影響を与える可能性が粒子の沈降を最小限に抑えるために使用される。 </li><li>滅菌チップをマイクロチューブにGBSの975μlを添加してP1000ピペットを用いて、その後ラテックス試薬（ すなわち、プール、グループ、タイプまたは因子）を調製されるための適切な肺炎球菌血清を25μl加える。混合する5回転倒。 </li><li>滅菌生理食塩水1,080μlにラテックス粒子の120μLを添加することにより、ポリスチレンラテックス粒子1:10に希釈する。 注：これは、より大きな体積で製造することができるが、ラテックス試薬が生成されるたびに新たに作製する必要がある。 </li><li> 1に（ステップ1.3.3で調製した）午前1時10分ラテックス懸濁液1,000μl加え、000μlの1時40抗血清懸濁液（ステップ1.3.2で調製した）。混合する5回転倒。 </li><li>ゆっくりと回転ホイール上で37℃でインキュベートする（ 例えば38.5センチ、直径の車輪4 rpm）で2時間。 </li><li> 1100×gで15分間遠心します。上澄みを捨て、優しく滅菌生理食塩水2mlにペレットを再懸濁します。 </li><li> 1100×gで15分間遠心します。上澄みを捨て、GBSの1ミリリットルを追加して、静かにペレットを再懸濁します。 </li><li>ラベル5ミリリットルにラテックス懸濁液をピペットにキャップをスクリュー管。 GBSの別の1ミリリットルを追加します。 </li><li> 0.2％BSA（w / v）の液（pH 8.2）（ステップ1.2で調製した）を含有するGBSの2ミリリットルを追加します。防腐剤としてアジ化ナトリウム（w / v）の10％の40を添加する。 注：アジ化ナトリウムは吸入すると有害であり、皮膚や眼への刺激性である。これは、吸入暴露の危険性を最小にするように、それは、むしろ粉末形態より調製された10％溶液を購入することが望ましい。手袋などの保護具（この試薬を取り扱う際のdスプラッシュゴーグル）を着用する必要があります。詳細については、製品安全データシートを参照してください。 </li><li> 4℃で保存ラテックス試薬。 </li></ol></li><li>陰性対照ラテックス試薬の調製<ol><li> 2ミリリットルの丸底マイクロチューブにラベルを付けます。 注：丸底チューブは、抗体の付着に影響を与える可能性が粒子の沈降を最小限に抑えるために使用される。 </li><li>滅菌チップをマイクロチューブにGBSの975μlを添加してP1000ピペットを用いて、その後25μlの正常ウサギ抗血清を追加します。混合する5回転倒。 </li><li>段階的に上記の1.3.10に1.3.3のように実行します</li></ol></li></ol>ラテックス試薬2。品質管理（QC） <ol><li> RTにラテックス試薬を持参してください。使用直前に、穏やかにチューブを数回反転させてラテックス試薬を混合する。 </li><li>ガラス顕微鏡スライド上に15μlのピペッティングして自己凝集のための試薬を確認し、ステップ4.7と以下の4.8のように進んでください。 Aいいえがあってはならないラテックス粒子のgglutination。試薬は、白とスムーズに表示されます。 </li><li>低継代肺炎球菌分離株のパネルに対する試薬をテストします。分離株のパネルは「ターゲット」血清型の分離株（試薬の具体的な血清型がテストされている）と &#39;非標的」血清型（通常は交差させない他の血清型の分離株が含まれている必要があり、手順3でのように調製したばかりの増殖させた培養物を使用してください）試薬と反応する。 QCを受けて、各ラテックス試薬のための各標的および非標的血清型のうちの少なくとも1つの単離を含めます。特定の血清型の唯一の標的または非標的血清型、テストつの異なる分離株が存在する場合。 注：テストパネルは侵襲性疾患および/または型培養コレクションにまれであるそのうちのいくつかは、各血清型のいくつかの分離株を含むべきである。彼らはしばしば血清型に対してより厳しいあるので、いくつかのキャリッジ単離物に含めることが好ましいことがある（データは示していない）、それによってさらに容量oをテストする試薬fと試薬が分離株の侵襲性とキャリッジの両方を血清型のできる可能性があることを保証します。 </li><li>標的および非標的の肺炎球菌によるラテックス試薬のテストを続行しますが、手順3と4以下に記載した方法に従って分離します。 </li><li>少なくとも年に一度、その後は品質管理、製造時の試薬および。 注：試薬はQCに合格しなかった場合、バッチは破棄され、新たな準備がなされなければならない。リピートQCに障害が発生した場合では、試薬はOrtika ら 、2013 8および以下の説明で説明されている代替方法を使用して製造することをお勧めします。 </li></ol>血清型用肺炎球菌培養の調製<ol><li>無菌ループを使用すると、肺炎球菌の単一コロニーを選択 一次接種物は、プレート表面の約3分の1を覆うように固体の非選択性血液寒天上にこれを分離し、連勝。単一のコロニーのためのストリーク。 注：脱線維素ウマやヒツジ血液から調製されたプレートが適している。しかし、ヒトの血液またはクエン酸処理動物の血液を用いて調製した血液プレートはありません。 </li><li> 5％CO 2の雰囲気中で37℃でプレートO / Nインキュベートする。 </li><li>純度のプレート上での成長を観察し、血清型別のために十分な成長があることを評価する。 注：肺炎球菌分離株の純粋培養は、血清型別に必要とされている。プレート表面の約3分の1をカバーする当社の経験、コンフルエント、またはコンフルエントに近い成長では通常、血清型別を完了するのに十分である。肺炎球菌培養物が自己分解しやすいかもしれたように、血清型別のために準備文化がサブカルチャーの24時間以内にテストする必要があります。血清型が始まる前に、15以上の20分に、インキュベーターから培養プレートを服用しないでください。 </li></ol>ラテックス凝集血清型を実施4。 <ol><li>冷蔵庫からすべてのラテックス試薬を除去し、それらを約室温に温めるimately 30分。使用直前に、静かに試薬を混合するためにチューブを反転。 </li><li>顕微鏡スライドにラベルを付けます。 </li><li>顕微鏡スライド上の陰性対照ラテックス試薬15μlのを置きます。 </li><li>ループが約半分になるように滅菌した使い捨て1μlのループを使用すると、肺炎球菌文化のスイープを取る。 </li><li>静かに陰性対照ラテックス試薬の滴に近いスライドの表面上に接種物を汚す。接種物をガラススライド上に表示されるはずです。 </li><li>迅速かつ徹底的にループを使用して、陰性対照ラテックス試薬に接種材料を混ぜる。ドロップがその最初のサイズよりさらに広がっていないことを確認してください。 </li><li>両端にそれを持って、スライドをピックアップ。前後に1分間のスライドをロック。ゆっくりと移動する液体を保持し、液滴の大きさが増加しないように注意してください。 注：別の方法として、プレートロッカーを使用しています。 </li><li>によって、すなわち （巨視的凝集のために守って裸眼）、黒背景に対してサスペンションのクリア。 </li><li>ネガティブコントロールラテックス試薬は凝集を示さないか、クリアは上記のステップ4.1から4.8に陰性対照ラテックス試薬用のテストラテックス試薬の交換、文化のテストを続行した場合。新鮮なループは、毎回使用する必要があります。プールで始まるラテックス試薬のテストを続行します。 </li><li>陽性の検査が得られるまで連続して &#39;プール&#39;ラテックス試薬のそれぞれをテストします。 注：プールのテストの順序は、例えば、最初のスライド上の3つの可能性が最も高いのプールをテストすることにより（特定の血清型のローカル発生率を反映するために&#39;ラウンド&#39;で行うことができる肯定的な反応が得られない場合、テスト）などが陽性反応が得られるまで、第二スライド上の残りのプールの最も可能性の高い次の3。これは、必要な時間と試薬を最小にする、最も一般的な血清型が最初にテストされることを保証する。 </li><li>抗血清の製造元のキーを使用すると、陽性プールで表現されている個別の抗血清を決定します。 </li><li>上記の手順4.1から4.8のように、「グループ」または「タイプ」を決定するために、個別に陽性プールに含まれているグループやタイプのそれぞれをテストします。 </li><li>抗血清の製造元のキーを参照することによって、その結果を決定します。 &#39;タイプ&#39;が（ 例えば、血清型5）と判定された場合、それ以上の試験は必要とされず、この結果が記録されている。 </li><li> &#39;グループ&#39;が（ 例えば、グループ19）と判定された場合、試験される因子を決定するために、製造者のキーを参照する。個人の要因」のラテックス試薬とテストを続行し、最終的な血清型（ 例えば、血清型19B）を決定する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010:+estimates+of+incidence,+severe+morbidity,+mortality,+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries.">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years:+global+estimates.">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li><li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae.">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li><li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease:+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use,+part+I.">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li><li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li><li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae:+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group.">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. , (2013).</li><li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping.">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li><li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003.">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li><li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+(Pneumotest-Latex).">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li><li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray.">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li><li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae.">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li><li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays:+a+cost-effective+technique+for+developing+countries.">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li><li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates.">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li><li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis.">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li><li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction.">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li><li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae.">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li><li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci.">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li><li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests.">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li><li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection.">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li><li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis.">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ラテックス凝集は、肺炎球菌血清型のため、簡単な、迅速かつ安価な方法である。市販の肺炎球菌ラテックス凝集試薬が利用可能であるが、それらは現在、すべての既知の肺炎球菌血清型10,12を区別しません。しかし、ラテックス凝集試薬は、容易に特定の肺炎球菌莢膜抗原に対して惹起購入した抗血清を用いて社内で製造することができる。ここに記載の方法において、抗体は、受動ラテックス凝集試薬のセットを作るためにラテックス粒子に結合している。 肺炎球菌の多糖カプセルは18,19を分離する上でラテックス粒子に結合した特異的抗体が抗原に接続すると、正のラテックス反応が起こる。抗体に付着したラテックス粒子は、特定の抗体 - 抗原反応は拡大せずに可視化することを可能にする。 ラテックス凝集法は、ハイスループット実験室のANに適した方法である資源の乏しい設定のためにもdは。ラテックス凝集法の主な利点には特殊な装置がテストを実行するために必要とされないことであり、試薬が4°C 8で保存した場合、少なくとも2年間の貯蔵寿命を有し、それは、安価で簡単かつ迅速であることを実行する。ラテックス凝集法による肺炎球菌分離株の血清型は、約10分を要し、最大4つのラテックス試薬は、1つのスライド上で並行して試験することができる。血清型の有病率は、関連する疫学的状況のために知られている場合にはさらに、テストは膨化試験17と同様に、最も一般的な血清型を含むプールが始まるのラウンドで行うことができる。このアプローチは、血清型を決定するために必要なテストの数を最小限に抑える。この方法はまた、異なるオペレータ間の高度に再現可能である（データは示さず）。ラテックス凝集型別の欠点は、試薬を製造するには、約4時間を考慮して、時間を消費することである。複数レアージュもののNTSは容易に並列的に製造することができる。さらに、いくつかの抗原は、いくつかの抗血清との交差反応で、その結果、異なる肺炎球菌血清型間で共通している（ 例えば 、血清型29、42とグループ35）。しかしながら、これらの交差反応（通常はより問題交差反応性抗体を除去するために前吸収される）は、市販の抗血清と追加の反応テーブルを使用する場合によく特徴づけされているが、存在する血清型を区別するために、製造業者によって提供される。抗体は、ラテックス粒子上に適切に位置合わせされていない場合、ラテックス試薬はまた、クロス反応し得る;これらは、QCの障害として検出される。われわれの経験では、厳格なQCは、市販の抗血清を製造するために使用される場合にも、この方法の成功の中心である。 QCは、試薬ごとに約15分かかりますし、適切な品質管理のセット上記のように隔離するに依存しています。 ここで説明する方法は、陽性反応ウェルw iを与える試薬になる試験期間薄い。われわれの経験では、偽陽性（データは示されていない）、実際にはまれである。時折偽陰性反応が観察される。通常、これらは、特定の抗血清の既知の問題（ 例えば、血清群6分離株はプールB抗血清と反応しない場合があります）、または分離株によるカプセル発現のダウンレギュレーションに関連している。偽陽性または陰性反応が「盲端」結果につながる多くの場合のように、製造業者によって提供される血清型algrorithmを使用することも重要である。反応は解釈が困難であるときに、これらのケースでは、そして、私たちはそのような膨張反応などの代替の方法で繰り返しテストおよび/またはテストすることをお勧めします。 いくつかのトラブルシューティングが時折満足なラテックス試薬を行う必要がある。ここで説明する方法では、抗体は、受動的吸着15,19を介してラテックス粒子に結合しているので、重要な変数はどれだけかを判断使用される抗体の濃度は、ラテックス粒子の表面を覆い、抗体の活性部位15,20のその後の位置合わせされている。不十分なまたは過剰な抗体をラテックス粒子に結合している場合にはその結果、抗体-抗原反応は最適ではなくなり、不満足な試薬は15,20,21を製造することができる。抗体価は、抗血清の異なるロット間で変化したように、希釈液の標準セットは、ウェル8を実行する試薬を生成しない場合があります。有用な出発点は、1:40希釈の抗血清を使用し、これが成功しない場合、さらなる抗血清を希釈することである。私たちの経験では、これは通常は問題を解決します8。症例数が少ないでは試薬は、標的分離株を用いて検査したときにサスペンションのクリアを伴わない弱い凝集を示してもよい。抗血清を希釈し、これらの場合に、試薬の質を改善しないが、良好な試薬は通常、遠心分離を省略することによって製造することができ、洗浄が8,22ステップ </sup&gt;。 抗体被覆ラテックス粒子は、多くの異なる微生物15,20の検出、同定または血清型のための診断微生物学で一般的に使用される。このように、ここで説明する方法は、適切な抗血清を入手し、適切なQC手順が採用されて提供され、他の目的のためのラテックス試薬を調製するために適切であり得る。

肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）は、特に資源の乏しい設定1,2で、世界的に5歳未満の子供における罹患率および死亡率の主要な原因である。肺炎、敗血症など生命を脅かす状況にローカライズされた感染症から肺炎球菌疾患の範囲とは、1,2髄膜炎。 肺炎球菌の90以上の血清型は、それらの莢膜多糖3の差に基づいて同定されている。現在のワクチンは、莢膜多糖を標的とし、侵襲性疾患の原因となる主要な4種の血清型からの保護を提供する。肺炎球菌血清型を分離することは台車や病気に対するワクチン接種の影響を評価するだけでなく、より広範な疫学的情報5,6を提供するために重要である。肺炎球菌血清型の現在の「ゴールドスタンダード」方法は膨化試験であるが、それは時間がかかり、perfoするためにいくつかのスキルが必要ですRM 7。ラテックス凝集は、世界保健機関7が推奨する代替血清型別法である。ラテックス凝集は、実行することが迅速かつ簡単であり、世界中で多くの研究室8-11に採用されている。重要なのは、ラテックス凝集法は、肺炎球菌血清型10,12-14ための膨化試験に匹敵する精度を示している。全体として、このメソッドは、リソースの乏しい設定だけでなく、ハイスループットラボに最適です。 ラテックス凝集試薬（「ラテックス試薬は&#39;）ラテックス粒子15に対する抗体の結合によって作成される。陽性反応では、これらの標識された粒子は、特定の抗原の存在下で凝集。市販のラテックス試薬は、血清型の制限された範囲で使用できます。ラテックス試薬はまた、市販の抗血清10を用いて社内で製造することができる。抗血清（「プール」）の混合物だけでなく、肺炎球菌sに特異的な抗血清さらにグループ内での血清型を定義するためのerogroups（ 例えば、グループ19）、個別の血 ​​清型（ 例えば、血清型5）、および特定の抗原に対する（ &#39;要因&#39;、 例えば 、血清型19Aを認識要因19cは）16用意されています。 この原稿は、ラテックス粒子に市販の抗血清の受動的な添付ファイルを用いたラテックス試薬の製造における主要なステップの概要を説明します。品質管理（QC）本方法の態様が記載されており、肺炎球菌血清型のためのラテックス試薬を使用するためのプロトコルが含まれている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1085">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:299px;">Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">65984-10 ml-F</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:180px;">Antibodies Australia&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NRS-1ml</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required, bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:299px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td style="width:180px;">SSI Diagnostica</td>
			<td style="width:127px;">Various</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sterile Bovine Albumin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">A-4503</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Sodium azide 10% (v/v) solution&#160;</td>
			<td style="width:180px;">VWR International</td>
			<td style="width:127px;">ROAC3902/100ml</td>
			<td style="width:263px;">Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">0030 120.094</td>
			<td style="width:263px;">Round bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10241.AP</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Calibrated disposable inoculating loops 1 &#181;l</td>
			<td style="width:180px;">Copan</td>
			<td style="width:127px;">CD175SO1</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:299px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">LBS 2950RC</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">5 M NaOH</td>
			<td style="width:180px;">BDH</td>
			<td style="width:127px;">10252</td>
			<td style="width:263px;">Caution: highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glycine</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10119.05</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PP2001</td>
			<td>Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Rotating wheel</td>
			<td style="width:180px;">Wyble Engineering Development Corporation</td>
			<td style="width:127px;">Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:299px;">Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td>
			<td style="width:180px;">Technoplas</td>
			<td style="width:127px;">S5016SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">60 ml syringes without needles</td>
			<td style="width:180px;">Terumo</td>
			<td style="width:127px;">SS-60L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:180px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:127px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Brochure on Neufeld antisera</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>Key to determining serotypes 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Key to pneumococcal factor serum</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td align="right" style="width:127px;">18058</td>
			<td style="width:263px;">For determining serotype within Groups 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">*alternative sources are available for most materials</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

ラテックス粒子に結合型特異的抗体は、肺炎球菌のカプセルに結合し、抗体標識された粒子の凝集が15に移行する。 図1（a）は、目に見える凝集や背景のクリアすることを特徴とする陽性反応を示す場合に正のラテックス反応が起こるサスペンション。陰性反応は、滑らかで、白色の残りのラテックス凝集試薬懸濁液（図1B）によって特徴付けられる。陽性反応は1分の時間間隔（約20秒、通常の検出可能）の終了前に観察されるべきであるように、試薬が最適化されています。私たちは、1分間の時間間隔の後の​​反応を読むことをお勧めしません。ごくまれに、反応は（データは示していない）背景懸濁液をクリアすることによって伴わないドロップのエッジの周りの弱い凝集を表示したり、背景なしのクリアと「糸」が表示されます。これらは、最もなどである<html> LY否定的な反応。このような場合、私たちは再試験および/ ​​または別の血 ​​清型別法（例えば膨張反応17）を使用してさらに調査することをお勧めします。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> 図1の正および負のラテックス凝集反応。陽性反応（A）または負の反応（B）を示すラテックス凝集試薬と混合肺炎球菌単離物の調製。背景の消去に伴う凝集が.There陰性対照ラテックス試薬または陰性試験反応（B）において目に見える凝集しない陽性反応（A）に見られる。写真8は、許可を得て使用。「ターゲット= &quot;_ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

ラテックス凝集試験は、 肺炎連鎖球菌の血清型のための、簡単、迅速かつ安価な方法であり、また広く診断微生物学に適用されている。この原稿は、ラテックス凝集試薬、品質管理手順の内製および肺炎球菌血清型に対するこの技術の応用を説明しています。

の莢膜血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;ラテックス凝集による

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K ビュー.  Murdoch Childrens Research Institute. ラテックス凝集試験は、 肺炎連鎖球菌の血清型のための、簡単、迅速かつ安価な方法であり、また広く診断微生物学に適用されている。この原稿は、ラテックス凝集試薬、品質管理手順の内製および肺炎球菌血清型に対するこの技術の応用を説明しています。 

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

免疫・感染学

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

メンブレン極性膜完全性、細胞内イオン濃度の監視の変更<em&gt;肺炎球菌</em&gt;蛍光染料を使用

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

の莢血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;膨張反応を使用して、

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

のゼブラフィッシュ幼生モデルにおける先天性免疫応答の非侵襲的イメージング<em&gt;ストレプトコッカスイニエ</em&gt;感染

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

グループBのマウスモデル<em&gt;連鎖球菌</em&gt;膣植民地化

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

免疫担当げっ歯類で堅牢な肺炎モデルはに対して抗菌有効性を評価するために<i&gt; S。ニューモニエ</i&gt;、<i&gt; H。インフルエンザ</i&gt;、<i&gt; K。ニューモニエ</i&gt;、<em&gt; P。緑膿菌</em&gt;または<em&gt; A。バウマニ</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...