Name: capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination
Uploaded: 2014-09-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
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This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

社内ラテックス試薬の調製<ol><li>グリシン緩衝食塩水（GBS）の調製<ol><li> 1.5グラムのグリシン、11.7グラムの塩化ナトリウムおよび200mlのガラス製ビーカーに100mlの蒸留水を加える。 </li><li>マグネチックスターラーを用いて溶解するために混合する。 </li><li>メスシリンダー500mlに混合を移し、200ミリリットルの合計を作るために蒸留水を加える。 </li><li> 、200ミリリットルのビーカーに戻って解決策を移し、pHをチェックし、5M水酸化ナトリウムで8.2に調整してください。注：水酸化ナトリウムは腐食性で、個人用保護具を着用してください。 </li><li>フィルターは250ミリリットルpreautoclavedスクリューキャップ付きガラス瓶に、0.22μMのフィルターと複数の60ミリリットルの注射器を用いて溶液を滅菌する。 </li><li> RTで保管してください。 </li></ol></li><li> 0.2％ウシ血清アルブミンGBSの調製<ol><li> 200mlのガラスビーカーにウシ血清アルブミン（BSA）粉末を0.2g、およびGBS 100ミリリットルを加え、マグネチックスターラーを用いて溶解するために混合する。 </li><li>フィルター250ミリリットルpreautoclavedスクリューキャップ付きガラス瓶に、いくつかの60ミリリットルの注射器を使用して、0.22μMのフィルターを通して溶液を滅菌する。 </li><li> 4℃で保存。 </li></ol></li><li>ラテックス試薬調製<ol><li> 2ミリリットルの丸底マイクロチューブにラベルを付けます。 注：丸底チューブは、抗体の付着に影響を与える可能性が粒子の沈降を最小限に抑えるために使用される。 </li><li>滅菌チップをマイクロチューブにGBSの975μlを添加してP1000ピペットを用いて、その後ラテックス試薬（ すなわち、プール、グループ、タイプまたは因子）を調製されるための適切な肺炎球菌血清を25μl加える。混合する5回転倒。 </li><li>滅菌生理食塩水1,080μlにラテックス粒子の120μLを添加することにより、ポリスチレンラテックス粒子1:10に希釈する。 注：これは、より大きな体積で製造することができるが、ラテックス試薬が生成されるたびに新たに作製する必要がある。 </li><li> 1に（ステップ1.3.3で調製した）午前1時10分ラテックス懸濁液1,000μl加え、000μlの1時40抗血清懸濁液（ステップ1.3.2で調製した）。混合する5回転倒。 </li><li>ゆっくりと回転ホイール上で37℃でインキュベートする（ 例えば38.5センチ、直径の車輪4 rpm）で2時間。 </li><li> 1100×gで15分間遠心します。上澄みを捨て、優しく滅菌生理食塩水2mlにペレットを再懸濁します。 </li><li> 1100×gで15分間遠心します。上澄みを捨て、GBSの1ミリリットルを追加して、静かにペレットを再懸濁します。 </li><li>ラベル5ミリリットルにラテックス懸濁液をピペットにキャップをスクリュー管。 GBSの別の1ミリリットルを追加します。 </li><li> 0.2％BSA（w / v）の液（pH 8.2）（ステップ1.2で調製した）を含有するGBSの2ミリリットルを追加します。防腐剤としてアジ化ナトリウム（w / v）の10％の40を添加する。 注：アジ化ナトリウムは吸入すると有害であり、皮膚や眼への刺激性である。これは、吸入暴露の危険性を最小にするように、それは、むしろ粉末形態より調製された10％溶液を購入することが望ましい。手袋などの保護具（この試薬を取り扱う際のdスプラッシュゴーグル）を着用する必要があります。詳細については、製品安全データシートを参照してください。 </li><li> 4℃で保存ラテックス試薬。 </li></ol></li><li>陰性対照ラテックス試薬の調製<ol><li> 2ミリリットルの丸底マイクロチューブにラベルを付けます。 注：丸底チューブは、抗体の付着に影響を与える可能性が粒子の沈降を最小限に抑えるために使用される。 </li><li>滅菌チップをマイクロチューブにGBSの975μlを添加してP1000ピペットを用いて、その後25μlの正常ウサギ抗血清を追加します。混合する5回転倒。 </li><li>段階的に上記の1.3.10に1.3.3のように実行します</li></ol></li></ol>ラテックス試薬2。品質管理（QC） <ol><li> RTにラテックス試薬を持参してください。使用直前に、穏やかにチューブを数回反転させてラテックス試薬を混合する。 </li><li>ガラス顕微鏡スライド上に15μlのピペッティングして自己凝集のための試薬を確認し、ステップ4.7と以下の4.8のように進んでください。 Aいいえがあってはならないラテックス粒子のgglutination。試薬は、白とスムーズに表示されます。 </li><li>低継代肺炎球菌分離株のパネルに対する試薬をテストします。分離株のパネルは「ターゲット」血清型の分離株（試薬の具体的な血清型がテストされている）と &#39;非標的」血清型（通常は交差させない他の血清型の分離株が含まれている必要があり、手順3でのように調製したばかりの増殖させた培養物を使用してください）試薬と反応する。 QCを受けて、各ラテックス試薬のための各標的および非標的血清型のうちの少なくとも1つの単離を含めます。特定の血清型の唯一の標的または非標的血清型、テストつの異なる分離株が存在する場合。 注：テストパネルは侵襲性疾患および/または型培養コレクションにまれであるそのうちのいくつかは、各血清型のいくつかの分離株を含むべきである。彼らはしばしば血清型に対してより厳しいあるので、いくつかのキャリッジ単離物に含めることが好ましいことがある（データは示していない）、それによってさらに容量oをテストする試薬fと試薬が分離株の侵襲性とキャリッジの両方を血清型のできる可能性があることを保証します。 </li><li>標的および非標的の肺炎球菌によるラテックス試薬のテストを続行しますが、手順3と4以下に記載した方法に従って分離します。 </li><li>少なくとも年に一度、その後は品質管理、製造時の試薬および。 注：試薬はQCに合格しなかった場合、バッチは破棄され、新たな準備がなされなければならない。リピートQCに障害が発生した場合では、試薬はOrtika ら 、2013 8および以下の説明で説明されている代替方法を使用して製造することをお勧めします。 </li></ol>血清型用肺炎球菌培養の調製<ol><li>無菌ループを使用すると、肺炎球菌の単一コロニーを選択 一次接種物は、プレート表面の約3分の1を覆うように固体の非選択性血液寒天上にこれを分離し、連勝。単一のコロニーのためのストリーク。 注：脱線維素ウマやヒツジ血液から調製されたプレートが適している。しかし、ヒトの血液またはクエン酸処理動物の血液を用いて調製した血液プレートはありません。 </li><li> 5％CO 2の雰囲気中で37℃でプレートO / Nインキュベートする。 </li><li>純度のプレート上での成長を観察し、血清型別のために十分な成長があることを評価する。 注：肺炎球菌分離株の純粋培養は、血清型別に必要とされている。プレート表面の約3分の1をカバーする当社の経験、コンフルエント、またはコンフルエントに近い成長では通常、血清型別を完了するのに十分である。肺炎球菌培養物が自己分解しやすいかもしれたように、血清型別のために準備文化がサブカルチャーの24時間以内にテストする必要があります。血清型が始まる前に、15以上の20分に、インキュベーターから培養プレートを服用しないでください。 </li></ol>ラテックス凝集血清型を実施4。 <ol><li>冷蔵庫からすべてのラテックス試薬を除去し、それらを約室温に温めるimately 30分。使用直前に、静かに試薬を混合するためにチューブを反転。 </li><li>顕微鏡スライドにラベルを付けます。 </li><li>顕微鏡スライド上の陰性対照ラテックス試薬15μlのを置きます。 </li><li>ループが約半分になるように滅菌した使い捨て1μlのループを使用すると、肺炎球菌文化のスイープを取る。 </li><li>静かに陰性対照ラテックス試薬の滴に近いスライドの表面上に接種物を汚す。接種物をガラススライド上に表示されるはずです。 </li><li>迅速かつ徹底的にループを使用して、陰性対照ラテックス試薬に接種材料を混ぜる。ドロップがその最初のサイズよりさらに広がっていないことを確認してください。 </li><li>両端にそれを持って、スライドをピックアップ。前後に1分間のスライドをロック。ゆっくりと移動する液体を保持し、液滴の大きさが増加しないように注意してください。 注：別の方法として、プレートロッカーを使用しています。 </li><li>によって、すなわち （巨視的凝集のために守って裸眼）、黒背景に対してサスペンションのクリア。 </li><li>ネガティブコントロールラテックス試薬は凝集を示さないか、クリアは上記のステップ4.1から4.8に陰性対照ラテックス試薬用のテストラテックス試薬の交換、文化のテストを続行した場合。新鮮なループは、毎回使用する必要があります。プールで始まるラテックス試薬のテストを続行します。 </li><li>陽性の検査が得られるまで連続して &#39;プール&#39;ラテックス試薬のそれぞれをテストします。 注：プールのテストの順序は、例えば、最初のスライド上の3つの可能性が最も高いのプールをテストすることにより（特定の血清型のローカル発生率を反映するために&#39;ラウンド&#39;で行うことができる肯定的な反応が得られない場合、テスト）などが陽性反応が得られるまで、第二スライド上の残りのプールの最も可能性の高い次の3。これは、必要な時間と試薬を最小にする、最も一般的な血清型が最初にテストされることを保証する。 </li><li>抗血清の製造元のキーを使用すると、陽性プールで表現されている個別の抗血清を決定します。 </li><li>上記の手順4.1から4.8のように、「グループ」または「タイプ」を決定するために、個別に陽性プールに含まれているグループやタイプのそれぞれをテストします。 </li><li>抗血清の製造元のキーを参照することによって、その結果を決定します。 &#39;タイプ&#39;が（ 例えば、血清型5）と判定された場合、それ以上の試験は必要とされず、この結果が記録されている。 </li><li> &#39;グループ&#39;が（ 例えば、グループ19）と判定された場合、試験される因子を決定するために、製造者のキーを参照する。個人の要因」のラテックス試薬とテストを続行し、最終的な血清型（ 例えば、血清型19B）を決定する。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ラテックス凝集は、肺炎球菌血清型のため、簡単な、迅速かつ安価な方法である。市販の肺炎球菌ラテックス凝集試薬が利用可能であるが、それらは現在、すべての既知の肺炎球菌血清型10,12を区別しません。しかし、ラテックス凝集試薬は、容易に特定の肺炎球菌莢膜抗原に対して惹起購入した抗血清を用いて社内で製造することができる。ここに記載の方法において、抗体は、受動ラテックス凝集試薬のセットを作るためにラテックス粒子に結合している。 肺炎球菌の多糖カプセルは18,19を分離する上でラテックス粒子に結合した特異的抗体が抗原に接続すると、正のラテックス反応が起こる。抗体に付着したラテックス粒子は、特定の抗体 - 抗原反応は拡大せずに可視化することを可能にする。 ラテックス凝集法は、ハイスループット実験室のANに適した方法である資源の乏しい設定のためにもdは。ラテックス凝集法の主な利点には特殊な装置がテストを実行するために必要とされないことであり、試薬が4°C 8で保存した場合、少なくとも2年間の貯蔵寿命を有し、それは、安価で簡単かつ迅速であることを実行する。ラテックス凝集法による肺炎球菌分離株の血清型は、約10分を要し、最大4つのラテックス試薬は、1つのスライド上で並行して試験することができる。血清型の有病率は、関連する疫学的状況のために知られている場合にはさらに、テストは膨化試験17と同様に、最も一般的な血清型を含むプールが始まるのラウンドで行うことができる。このアプローチは、血清型を決定するために必要なテストの数を最小限に抑える。この方法はまた、異なるオペレータ間の高度に再現可能である（データは示さず）。ラテックス凝集型別の欠点は、試薬を製造するには、約4時間を考慮して、時間を消費することである。複数レアージュもののNTSは容易に並列的に製造することができる。さらに、いくつかの抗原は、いくつかの抗血清との交差反応で、その結果、異なる肺炎球菌血清型間で共通している（ 例えば 、血清型29、42とグループ35）。しかしながら、これらの交差反応（通常はより問題交差反応性抗体を除去するために前吸収される）は、市販の抗血清と追加の反応テーブルを使用する場合によく特徴づけされているが、存在する血清型を区別するために、製造業者によって提供される。抗体は、ラテックス粒子上に適切に位置合わせされていない場合、ラテックス試薬はまた、クロス反応し得る;これらは、QCの障害として検出される。われわれの経験では、厳格なQCは、市販の抗血清を製造するために使用される場合にも、この方法の成功の中心である。 QCは、試薬ごとに約15分かかりますし、適切な品質管理のセット上記のように隔離するに依存しています。 ここで説明する方法は、陽性反応ウェルw iを与える試薬になる試験期間薄い。われわれの経験では、偽陽性（データは示されていない）、実際にはまれである。時折偽陰性反応が観察される。通常、これらは、特定の抗血清の既知の問題（ 例えば、血清群6分離株はプールB抗血清と反応しない場合があります）、または分離株によるカプセル発現のダウンレギュレーションに関連している。偽陽性または陰性反応が「盲端」結果につながる多くの場合のように、製造業者によって提供される血清型algrorithmを使用することも重要である。反応は解釈が困難であるときに、これらのケースでは、そして、私たちはそのような膨張反応などの代替の方法で繰り返しテストおよび/またはテストすることをお勧めします。 いくつかのトラブルシューティングが時折満足なラテックス試薬を行う必要がある。ここで説明する方法では、抗体は、受動的吸着15,19を介してラテックス粒子に結合しているので、重要な変数はどれだけかを判断使用される抗体の濃度は、ラテックス粒子の表面を覆い、抗体の活性部位15,20のその後の位置合わせされている。不十分なまたは過剰な抗体をラテックス粒子に結合している場合にはその結果、抗体-抗原反応は最適ではなくなり、不満足な試薬は15,20,21を製造することができる。抗体価は、抗血清の異なるロット間で変化したように、希釈液の標準セットは、ウェル8を実行する試薬を生成しない場合があります。有用な出発点は、1:40希釈の抗血清を使用し、これが成功しない場合、さらなる抗血清を希釈することである。私たちの経験では、これは通常は問題を解決します8。症例数が少ないでは試薬は、標的分離株を用いて検査したときにサスペンションのクリアを伴わない弱い凝集を示してもよい。抗血清を希釈し、これらの場合に、試薬の質を改善しないが、良好な試薬は通常、遠心分離を省略することによって製造することができ、洗浄が8,22ステップ </sup&gt;。 抗体被覆ラテックス粒子は、多くの異なる微生物15,20の検出、同定または血清型のための診断微生物学で一般的に使用される。このように、ここで説明する方法は、適切な抗血清を入手し、適切なQC手順が採用されて提供され、他の目的のためのラテックス試薬を調製するために適切であり得る。

肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）は、特に資源の乏しい設定1,2で、世界的に5歳未満の子供における罹患率および死亡率の主要な原因である。肺炎、敗血症など生命を脅かす状況にローカライズされた感染症から肺炎球菌疾患の範囲とは、1,2髄膜炎。 肺炎球菌の90以上の血清型は、それらの莢膜多糖3の差に基づいて同定されている。現在のワクチンは、莢膜多糖を標的とし、侵襲性疾患の原因となる主要な4種の血清型からの保護を提供する。肺炎球菌血清型を分離することは台車や病気に対するワクチン接種の影響を評価するだけでなく、より広範な疫学的情報5,6を提供するために重要である。肺炎球菌血清型の現在の「ゴールドスタンダード」方法は膨化試験であるが、それは時間がかかり、perfoするためにいくつかのスキルが必要ですRM 7。ラテックス凝集は、世界保健機関7が推奨する代替血清型別法である。ラテックス凝集は、実行することが迅速かつ簡単であり、世界中で多くの研究室8-11に採用されている。重要なのは、ラテックス凝集法は、肺炎球菌血清型10,12-14ための膨化試験に匹敵する精度を示している。全体として、このメソッドは、リソースの乏しい設定だけでなく、ハイスループットラボに最適です。 ラテックス凝集試薬（「ラテックス試薬は&#39;）ラテックス粒子15に対する抗体の結合によって作成される。陽性反応では、これらの標識された粒子は、特定の抗原の存在下で凝集。市販のラテックス試薬は、血清型の制限された範囲で使用できます。ラテックス試薬はまた、市販の抗血清10を用いて社内で製造することができる。抗血清（「プール」）の混合物だけでなく、肺炎球菌sに特異的な抗血清さらにグループ内での血清型を定義するためのerogroups（ 例えば、グループ19）、個別の血 ​​清型（ 例えば、血清型5）、および特定の抗原に対する（ &#39;要因&#39;、 例えば 、血清型19Aを認識要因19cは）16用意されています。 この原稿は、ラテックス粒子に市販の抗血清の受動的な添付ファイルを用いたラテックス試薬の製造における主要なステップの概要を説明します。品質管理（QC）本方法の態様が記載されており、肺炎球菌血清型のためのラテックス試薬を使用するためのプロトコルが含まれている。

<table><tbody><tr><td>Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>Or other volumes as required</td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Antibodies Australia&amp;nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>Or other volumes as required, bring to RT before use</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) antisera</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Various</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Bring to rRT before use</td></tr><tr><td>Sodium azide 10% (v/v) solution&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Round bottom</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Calibrated disposable inoculating loops 1 &amp;micro;l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Caution: highly corrosive</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Horse Blood Agar (HBA) plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com.au/&quot;&gt;http://www.thermofisher.com.au&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Rotating wheel</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringes without needles</td><td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Brochure on Neufeld antisera</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Key to determining serotypes&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Key to pneumococcal factor serum</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>For determining serotype within Groups&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>*alternative sources are available for most materials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

ラテックス粒子に結合型特異的抗体は、肺炎球菌のカプセルに結合し、抗体標識された粒子の凝集が15に移行する。 図1（a）は、目に見える凝集や背景のクリアすることを特徴とする陽性反応を示す場合に正のラテックス反応が起こるサスペンション。陰性反応は、滑らかで、白色の残りのラテックス凝集試薬懸濁液（図1B）によって特徴付けられる。陽性反応は1分の時間間隔（約20秒、通常の検出可能）の終了前に観察されるべきであるように、試薬が最適化されています。私たちは、1分間の時間間隔の後の​​反応を読むことをお勧めしません。ごくまれに、反応は（データは示していない）背景懸濁液をクリアすることによって伴わないドロップのエッジの周りの弱い凝集を表示したり、背景なしのクリアと「糸」が表示されます。これらは、最もなどである<html> LY否定的な反応。このような場合、私たちは再試験および/ ​​または別の血 ​​清型別法（例えば膨張反応17）を使用してさらに調査することをお勧めします。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> 図1の正および負のラテックス凝集反応。陽性反応（A）または負の反応（B）を示すラテックス凝集試薬と混合肺炎球菌単離物の調製。背景の消去に伴う凝集が.There陰性対照ラテックス試薬または陰性試験反応（B）において目に見える凝集しない陽性反応（A）に見られる。写真8は、許可を得て使用。「ターゲット= &quot;_ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

ラテックス凝集試験は、 肺炎連鎖球菌の血清型のための、簡単、迅速かつ安価な方法であり、また広く診断微生物学に適用されている。この原稿は、ラテックス凝集試薬、品質管理手順の内製および肺炎球菌血清型に対するこの技術の応用を説明しています。

の莢膜血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;ラテックス凝集による

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.8K ビュー.  Murdoch Childrens Research Institute. ラテックス凝集試験は、 肺炎連鎖球菌の血清型のための、簡単、迅速かつ安価な方法であり、また広く診断微生物学に適用されている。この原稿は、ラテックス凝集試薬、品質管理手順の内製および肺炎球菌血清型に対するこの技術の応用を説明しています。 

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

免疫・感染学

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

生化学

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

医学

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

の莢血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;膨張反応を使用して、

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

の可視化<em&gt;肺炎球菌</em&gt;心臓Microlesionsとその後の心臓リモデリングの中

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new protein functions or to have access to protein conjugates. Stop codon suppression, in particular amber codon suppression, has emerged as the most popular method to genetically introduce UAAs at defined positions. This methodology is herein applied to the preparation of a carrier protein containing an UAA harboring a bioorthogonal functional group. This reactive handle can next be used to specifically and efficiently graft a synthetic oligosaccharide hapten to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine. The protocol is limited to the synthesis of glycoconjugates in a 1:1 carbohydrate hapten/carrier protein ratio but amenable to numerous pairs of biorthogonal functional groups. Glycococonjugate vaccine homogeneity is an important criterion to ensure complete physico-chemical characterization, thereby, satisfying more and more demanding drug regulatory agency recommendations, a criterion which is unmet by classical conjugation strategies. Moreover, this protocol makes it possible to finely tune the structure of the actual conjugate vaccine, giving rise to tools to address structure-immunogenicity relationships.

Genetic code expansion is applied for the introduction of an unnatural amino acid bearing a biorthogonal functional group on a carrier protein at a defined site. The biorthogonal function is further used for the site-selective coupling of a carbohydrate antigen to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine.

ワクチン用非天然アミノ酸組み合わせとクリック化学を組み合わせた均質なグリココンジュゲート

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

生物工学

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

細菌性アン トラシス および他のカプセル化病原体に対するワクチン開発における機能性抗体を評価するオソノ付着アッセイ

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

の莢膜血清型

要約

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ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

実験的な人間の肺炎球菌キャリッジ

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

の莢血清型

の可視化

ワクチン用非天然アミノ酸組み合わせとクリック化学を組み合わせた均質なグリココンジュゲート

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

細菌性アントラシスおよび他のカプセル化病原体に対するワクチン開発における機能性抗体を評価するオソノ付着アッセイ

血清型1肺炎球菌519/43株における変異体の構築

の莢膜血清型

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炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

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の莢血清型

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ワクチン用非天然アミノ酸組み合わせとクリック化学を組み合わせた均質なグリココンジュゲート

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

細菌性アン トラシス および他のカプセル化病原体に対するワクチン開発における機能性抗体を評価するオソノ付着アッセイ

血清型1肺 炎球 菌519/43株における変異体の構築

細菌性アントラシスおよび他のカプセル化病原体に対するワクチン開発における機能性抗体を評価するオソノ付着アッセイ

血清型1肺炎球菌519/43株における変異体の構築