This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1 Preparación de internos Reactivos de látex <ol><li> Preparación de glicina salina tamponada (GBS) <ol><li> Añadir 1,5 g de glicina, 11,7 g de cloruro de sodio y 100 ml de agua destilada a un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml. </li><li> Mezclar para disolver utilizando un agitador magnético. </li><li> Transferir la mezcla a 500 ml cilindro de medición y añadir agua destilada para hacer un total de 200 ml. </li><li> Transferir la solución de nuevo a la taza de 200 ml, comprobar el pH y ajustar a 8,2 con hidróxido de sodio 5 M. NOTA: El hidróxido de sodio es corrosivo, usar equipo de protección personal. </li><li> Filtro de esterilizar la solución con 0,22 M filtros y varias jeringas 60 ml en una botella de vidrio ml preautoclaved tornillo de tope 250. </li><li> Guarde a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparación de GBS con 0,2% de albúmina de suero bovino <ol><li> Añadir 0,2 g de albúmina de suero bovino (BSA) en polvo y 100 ml de GBS a un vaso de precipitados de vidrio de 200 ml y mezclar para disolver utilizando un agitador magnético. </li><li> Filtroesterilizar la solución a través de filtros de 0,22 M utilizando varias jeringas de 60 ml en un ml preautoclaved tornillo de botella de vidrio cubiertas 250. </li><li> Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> La preparación de reactivo de látex <ol><li> Etiquetar a 2 ml redondas tubo de microcentrífuga inferior. NOTA: redondo tubos de fondo se utilizan para minimizar la sedimentación de partículas que pueden afectar el apego anticuerpo. </li><li> Con una pipeta P1000 con puntas estériles añaden 975 l de EGB en el tubo de microcentrífuga, a continuación, añadir 25 l de antisuero neumocócica apropiado para el reactivo de látex está preparando (es decir, la piscina, grupo, tipo o factor). Invierta cinco veces para mezclar. </li><li> Diluir partículas de látex de poliestireno 1:10 añadiendo 120 l de partículas de látex para 1.080 l de solución salina fisiológica estéril. NOTA: Este puede hacerse en volúmenes más grandes, pero debe hacerse de nuevo cada vez que se producen los reactivos de látex. </li><li> Añadir 1,000 l de la suspensión de látex 1:10 (preparado en el paso 1.3.3) a los 1,000 l de suspensión 1:40 antisuero (preparado en la etapa 1.3.2). Invierta cinco veces para mezclar. </li><li> Incubar a 37 ° C en una rueda que gira lentamente (por ejemplo, 4 rpm para una rueda de 38,5 cm de diámetro) durante 2 horas. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 1100 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento en 2 ml de solución salina estéril. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 1100 x g. Descartar el sobrenadante y añadir 1 ml de GBS y resuspender suavemente el pellet. </li><li> Pipetear la suspensión de látex en una etiqueta rosca de 5 ml tubo tapado. Agregar otro 1 ml de GBS. </li><li> Añadir 2 ml de GBS que contiene 0,2% de BSA (w / v) (pH 8,2) (preparado en el paso 1.2). Añadir 40 l de 10% (w / v) de azida sódica como conservante. NOTA: La azida sódica es peligroso en caso de inhalación, y es un irritante de la piel y los ojos. Es deseable comprar una solución preparada al 10% en lugar de la forma en polvo, ya que esto minimiza el riesgo de exposición por inhalación. Equipo de protección personal (guantes incluidos ungafas d salpicaduras) se deben utilizar para la manipulación de este reactivo. Consulte la hoja de datos de seguridad para obtener más información. </li><li> Reactivos de látex Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparación de reactivo de látex control negativo <ol><li> Etiquetar a 2 ml redondas tubo de microcentrífuga inferior. NOTA: redondo tubos de fondo se utilizan para minimizar la sedimentación de partículas que pueden afectar el apego anticuerpo. </li><li> Con una pipeta P1000 con puntas estériles añaden 975 l de EGB en el tubo de microcentrífuga, a continuación, añadir 25 l de antisuero de conejo normal. Invierta cinco veces para mezclar. </li><li> Proceda como en los pasos 1.3.3 al 1.3.10 arriba </li></ol></li></ol> 2. Control de Calidad (QC) de látex Reactivos <ol><li> Llevar reactivo de látex a RT. Inmediatamente antes de su uso, mezclar suavemente el reactivo de látex invirtiendo el tubo varias veces. </li><li> Compruebe reactivo para autoaglutinación pipeteando 15 l sobre un portaobjetos de vidrio y proceder como en los pasos 4.7 y 4.8 a continuación. No debe haber ungglutination de las partículas de látex. El reactivo debe aparecer en blanco y liso. </li><li> Pruebe el reactivo frente a un panel de pocos pases aislamientos de neumococo. Utilice las culturas recién crecido preparados como en el paso 3 El panel de cepas debería incluir aislamientos del serotipo &#39;target&#39; (el serotipo específico para el reactivo está probando) y serotipos &#39;no objetivo&#39; (cepas de otros serotipos que normalmente no debe cruzar reaccionar con el reactivo). Incluya al menos una cepa de cada objetivo y no objetivo serotipo para cada reactivo de látex someterse QC. Si sólo hay un objetivo o serotipo no objetivo, probar dos cepas diferentes del serotipo particular. NOTA: El panel de prueba debe incluir varios aislamientos de cada serotipo, algunos de los cuales son comunes en la enfermedad invasiva y / o colecciones de cultivos tipo. Es preferible incluir algún carro aislados, ya que a menudo son más exigentes al serotipo (datos no presentados), con lo que la prueba aún más la capacidad of los reactivos y asegurar que los reactivos son probablemente capaces de serotipificación tanto invasiva y el carro aislados. </li><li> Proceder con la prueba de reactivos de látex con neumocócica objetivo y no objetivo aislamientos según el método descrito en los pasos 3 y 4 a continuación. </li><li> Reactivos de control de calidad en el momento de la producción y al menos anualmente a partir de entonces. NOTA: Si un reactivo no pasa QC, el lote debe ser desechado y una nueva preparación hecha. En el caso de fallo de repetición QC recomendamos los reactivos pueden producir usando los métodos alternativos descritos en Ortika et al., 2013 8 y en la discusión a continuación. </li></ol> 3 Preparación de las Culturas antineumocócicas para Serotipificación <ol><li> Utilizando un asa estéril seleccionar una sola colonia de la antineumocócica aislar y consecutivas esto en un sólido de agar sangre no selectivo de modo que el inóculo primario cubre aproximadamente un tercio de la superficie de la placa. Racha de colonias individuales. NOTA: Las placas preparadas a partir de caballo desfibrinada o sangre de oveja son adecuados; pero las placas de sangre preparadas con sangre humana o sangre de animal tratado con citrato no lo son. </li><li> Incubar la placa O / N a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. </li><li> Observar el crecimiento en la placa por la pureza y evaluar que hay un crecimiento suficiente para serotipificación. NOTA: Un cultivo puro de la cepa neumocócica es necesaria para la serotipificación. En nuestra experiencia, confluente, o cerca de la confluencia de crecimiento que cubre aproximadamente un tercio de la superficie de la placa es generalmente suficiente para completar la serotipificación. Como las culturas neumocócicas pueden ser propensos a la autolisis, cultivos preparados para serotipificación deben probarse dentro de las 24 horas de la subcultura. No tome la placa de cultivo de la incubadora más de 15 a 20 min antes de que comience el serotipado. </li></ol> 4. Realización Serotipificación látex aglutinación <ol><li> Retire todos los reactivos de látex de la nevera y deje que alcancen la temperatura ambiente durante aproxmadamente 30 min. Inmediatamente antes de su uso, invertir suavemente los tubos para mezclar los reactivos. </li><li> Etiquetar un portaobjetos de microscopio. </li><li> Coloque 15 l de reactivo de látex de control negativo en el portaobjetos de un microscopio. </li><li> El uso de un bucle de 1 l desechable estéril tomar un barrido de la cultura neumocócica manera que el bucle es de aproximadamente la mitad. </li><li> Manchar suavemente el inóculo sobre la superficie de la corredera cerca de la gota de reactivo de látex control negativo. El inóculo debe ser visible en el portaobjetos de vidrio. </li><li> Rápidamente ya fondo mezclar el inóculo en el reactivo de látex control negativo utilizando el bucle. Asegúrese de que la caída no se propaga más allá de su tamaño inicial. </li><li> Recoge la diapositiva, sujetándola por ambos extremos. Rock the slide de ida y vuelta durante 1 min. Tenga cuidado para que el líquido se mueve lentamente, y asegurarse de que el tamaño de la gota no aumenta. NOTA: Como alternativa, utilice un rockero plato. </li><li> Observar la aglutinación macroscópica (es decir, pora simple vista) y la limpieza de la suspensión contra un fondo negro. </li><li> Si el reactivo de látex de control negativo no muestra aglutinación o compensación continuar probando la cultura, en sustitución de los reactivos de látex de prueba para el reactivo de látex de control negativo en los pasos 4.1 a 4.8 anteriormente. Un bucle fresco debe ser utilizado cada vez. Proceda con la prueba de los reactivos de látex que comienzan con las piscinas. </li><li> Pon a prueba cada uno de los reactivos de látex &#39;pool&#39; en la serie hasta que se obtenga un resultado positivo. NOTA:. El orden de las pruebas de las piscinas se pueden hacer en &quot;rounds&quot; para reflejar la incidencia local de serotipos particulares (por ejemplo, mediante pruebas de las tres piscinas más probables en la primera diapositiva Si no se obtiene una reacción positiva, entonces prueba los próximos tres más probable de las piscinas restantes de la segunda corredera, y así sucesivamente hasta que se obtiene una reacción positiva). Esto asegura que los serotipos más comunes se prueban primero, minimizando el tiempo y reactivos necesarios. </li><li>Uso de la tecla del fabricante antisueros determinar qué antisueros individuales están representados en el grupo positivo. </li><li> Pon a prueba cada uno de los grupos o tipos que figuran en la piscina positivo individual para determinar el &#39;grupo&#39; o &#39;tipo&#39; como en los pasos 4.1 a 4.8 anteriormente. </li><li> Determinar el resultado por referencia a la tecla del fabricante antisueros. Si se determina que un &quot;tipo&quot; (por ejemplo, el serotipo 5), entonces no se necesita más pruebas y este resultado se registra. </li><li> Si se determina que un &quot;grupo&quot; (por ejemplo, grupo 19), a continuación, hacer referencia a la clave de los fabricantes para determinar los factores que deben ser evaluados. Continuar las pruebas con los reactivos de látex individuales &#39;Factor&#39; y determinar el serotipo final (por ejemplo, el serotipo 19B). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aglutinación de látex es un método simple, rápido y barato para la serotipificación neumocócica. Neumocócicas reactivos de aglutinación de látex comerciales están disponibles, pero en la actualidad no diferencian todo neumocócica conocida serotipos 10,12. Sin embargo, los reactivos de aglutinación de látex pueden ser fácilmente producidos en la empresa utilizando antisueros comprado levantado contra los antígenos capsulares de neumococos específicos. En el método descrito aquí, los anticuerpos se unen a pasivamente partículas de látex para hacer un conjunto de reactivos de aglutinación de látex. Una reacción positiva de látex se produce cuando los anticuerpos específicos unidos a las partículas de látex se unen a antígenos en la cápsula de polisacáridos del neumococo aislar 18,19. Las partículas de látex unidos a los anticuerpos permiten la reacción específica antígeno-anticuerpo para ser visualizado sin aumento. Aglutinación de látex es un método adecuado para laboratorios de alto rendimiento de unD también para entornos de escasos recursos. Principales ventajas del método de aglutinación de látex son que no se requiere equipo especializado para realizar la prueba, los reactivos tienen una vida útil de al menos 2 años cuando se almacena a 4 ° C 8, y que es barato, sencillo y rápido de realizar. Serotipificación un aislado neumocócica por aglutinación de látex tarda aproximadamente 10 min, y hasta cuatro reactivos de látex se puede probar en paralelo por una diapositiva. Además, si la prevalencia de los serotipos es conocido por el ajuste epidemiológica pertinente, las pruebas pueden llevarse a cabo en rondas empezando con las piscinas que contienen los serotipos más comunes de manera similar a la prueba de Quellung 17. Este enfoque minimiza el número de ensayos necesarios para determinar el serotipo. El método también es altamente reproducible entre diferentes operadores (datos no presentados). Una desventaja de la serotipificación de aglutinación del látex es que la producción de los reactivos es mucho tiempo, teniendo aproximadamente 4 horas; aunque múltiples ReageNTS puede ser fácilmente producido en paralelo. Además, algunos antígenos son comunes a través de diferentes serotipos de neumococo, resultando en reacciones cruzadas con algunos antisueros (por ejemplo, el serotipo 29, 42 y el Grupo 35). Sin embargo, estas reacciones cruzadas están bien caracterizados utilizando antisueros comerciales (que generalmente se preabsorbió para eliminar los anticuerpos de reacción cruzada más problemáticas) y tablas de reacción adicionales se proporcionan por el fabricante con el fin de distinguir qué serotipo está presente. Reactivos de látex también pueden cruzar reaccionar si los anticuerpos no están alineados correctamente en las partículas de látex; éstos son detectados como fallas de control de calidad. En nuestra experiencia, riguroso control de calidad es fundamental para el éxito de este método, incluso cuando se utilizan antisueros disponibles comercialmente para la producción. QC tarda aproximadamente 15 min por reactivo y se basa en un conjunto de control de calidad apropiado aislados como se describe anteriormente. El método aquí descrito da lugar a reactivos que dan una reacción positiva así widelgada el periodo de prueba. En nuestra experiencia, los falsos positivos son raros en la práctica (datos no mostrados). Se observan reacciones negativas falsas ocasionales; por lo general se relacionan con problemas conocidos con un antisuero en particular (por ejemplo, el serogrupo 6 aislados no pueden reaccionar con piscina B antisuero), o regulación a la baja de la expresión de la cápsula por el aislado. Usando el algrorithm serotipificación proporcionado por el fabricante es también importante, ya que en la mayoría de los casos una reacción positiva o negativa falsa dará lugar a un resultado &quot;extremo ciego &#39;. En estos casos, y cuando las reacciones son difíciles de interpretar, se recomienda repetir la prueba-y / o ensayo por un método alternativo tal como la reacción de Quellung. Algunos de solución de problemas en ocasiones se requiere para hacer los reactivos de látex satisfactorios. En el método descrito aquí, el anticuerpo se une a partículas de látex a través de adsorción pasiva 15,19, por lo que una variable crítica es la concentración de anticuerpo utilizado, que determina qué tan bienla superficie de las partículas de látex se cubre y la posterior alineación de los sitios activos de anticuerpos 15,20. En consecuencia, si el exceso de anticuerpo insuficiente o está unido a las partículas de látex, las reacciones antígeno-anticuerpo no será óptima, y los reactivos pueden ser insatisfactorios producido 15,20,21. Como los títulos de anticuerpos varían entre los diferentes lotes de antisueros, un conjunto estándar de diluciones puede no producir los reactivos que se desempeñan bien 8. Un punto de partida útil es el uso de una dilución 1:40 de antisuero, y si esto no tiene éxito, diluir el antisuero más. En nuestra experiencia, esto generalmente se resuelve el problema 8. En un pequeño número de casos reactivos pueden mostrar aglutinación débil que no vaya acompañado de la limpieza de la suspensión cuando se prueba con destino aísla. En estos casos diluir el antisuero no mejora la calidad del reactivo, pero los reactivos satisfactorios por lo general pueden ser producidos por la omisión de la centrifugación y etapas de lavado 8,22 </sup&gt;. Partículas de látex recubiertas de anticuerpo se utilizan comúnmente en microbiología de diagnóstico para la detección, identificación o el serotipado de muchos microbios diferentes 15,20. Como tal, el método descrito aquí puede ser adecuado para la preparación de reactivos de látex para otros fines, siempre antisueros adecuado está disponible y los procedimientos de control de calidad adecuados son adoptados.

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es una causa importante de morbilidad y mortalidad en los niños menores de cinco años de edad, sobre todo en entornos de escasos recursos en todo el mundo 1,2. Rangos de enfermedad neumocócica de infecciones localizadas a condiciones que amenazan la vida tales como la neumonía, sepsis y meningitis 1,2. Más de 90 serotipos de neumococo se han identificado sobre la base de las diferencias en su polisacárido capsular 3. Las vacunas actuales se dirigen al polisacárido capsular y proporcionan protección contra los principales serotipos causantes de enfermedad invasiva 4. Serotipificación neumocócica aislamientos es importante para evaluar el impacto de la vacunación en el carro y la enfermedad, así como proporcionar información epidemiológica más amplia de 5,6. El método actual &quot;estándar de oro&quot; para la serotipificación neumocócica es la prueba Quellung, pero es mucho tiempo y requiere cierta habilidad para perform 7. Aglutinación de látex es un método serotipificación alternativa recomendada por la Organización Mundial de la Salud 7. Aglutinación de látex es rápido y fácil de realizar, y se emplea en muchos laboratorios en todo el mundo 8-11. Es importante destacar que, de aglutinación de látex ha demostrado una precisión comparable a la prueba Quellung para serotipificación neumocócica 10,12-14. En general, este método es ideal para entornos de escasos recursos, así como laboratorios de alto rendimiento. Reactivos de aglutinación del látex (&#39;reactivos de látex&#39;) son creados por la unión de anticuerpos a partículas de látex 15. En una reacción positiva, estas partículas marcadas se aglutinan en presencia de antígeno específico. Reactivos de látex comerciales están disponibles para un rango limitado de serotipos. Reactivos de látex también se pueden preparar en casa utilizando comercialmente disponibles antisueros 10. Las mezclas de antisueros (&#39;piscinas&#39;), así como antisueros específicos para s neumocócicaserogroups (por ejemplo, grupo 19), los serotipos individuales (por ejemplo, el serotipo 5), y a los antígenos específicos (&quot;factores&quot;, por ejemplo., factor de reconocimiento de serotipo 19A 19C) para definir aún más serotipos dentro de los grupos están disponibles 16. Este manuscrito describe los pasos principales en la producción de reactivos de látex utilizando fijación pasiva de antisueros disponibles comercialmente a las partículas de látex. Se describen los controles de calidad (QC) aspectos de este método, y un protocolo para el uso de reactivos de látex para la serotipificación neumocócica está incluido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1085">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:299px;">Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">65984-10 ml-F</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:180px;">Antibodies Australia&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NRS-1ml</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required, bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:299px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td style="width:180px;">SSI Diagnostica</td>
			<td style="width:127px;">Various</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sterile Bovine Albumin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">A-4503</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Sodium azide 10% (v/v) solution&#160;</td>
			<td style="width:180px;">VWR International</td>
			<td style="width:127px;">ROAC3902/100ml</td>
			<td style="width:263px;">Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">0030 120.094</td>
			<td style="width:263px;">Round bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10241.AP</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Calibrated disposable inoculating loops 1 &#181;l</td>
			<td style="width:180px;">Copan</td>
			<td style="width:127px;">CD175SO1</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:299px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">LBS 2950RC</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">5 M NaOH</td>
			<td style="width:180px;">BDH</td>
			<td style="width:127px;">10252</td>
			<td style="width:263px;">Caution: highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glycine</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10119.05</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PP2001</td>
			<td>Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Rotating wheel</td>
			<td style="width:180px;">Wyble Engineering Development Corporation</td>
			<td style="width:127px;">Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:299px;">Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td>
			<td style="width:180px;">Technoplas</td>
			<td style="width:127px;">S5016SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">60 ml syringes without needles</td>
			<td style="width:180px;">Terumo</td>
			<td style="width:127px;">SS-60L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:180px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:127px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Brochure on Neufeld antisera</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>Key to determining serotypes 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Key to pneumococcal factor serum</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td align="right" style="width:127px;">18058</td>
			<td style="width:263px;">For determining serotype within Groups 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">*alternative sources are available for most materials</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Una reacción positiva de látex se produce cuando el anticuerpo específico del tipo unido a la partícula de látex se une a la cápsula del neumococo, y la aglutinación de las partículas de anticuerpo marcado se produce 15. Figura 1A muestra una reacción positiva que se caracteriza por aglutinación visible y la limpieza de los antecedentes suspensión. Una reacción negativa se caracteriza por la suspensión de reactivo de aglutinación de látex blanco restante suave y (Figura 1B). Los reactivos se optimizan de manera que una reacción positiva se debe observar antes de que el final del intervalo de tiempo de un minuto (normalmente detectable en aproximadamente 20 segundos). No se recomienda la lectura de las reacciones después del intervalo de tiempo de 1 min. Muy ocasionalmente, reacciones muestran aglutinación débil alrededor del borde de la gota que no vaya acompañado de la limpieza de la suspensión de fondo, o aparece &#39;viscosa&#39; sin compensación fondo (datos no mostrados). Estos son como más<html> reacciones negativas ly. En tales casos, se recomienda volver a probar y / o una mayor investigación utilizando otro método serotipificación (por ejemplo, la reacción de Quellung 17). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. reacciones de aglutinación de látex positivos y negativos. Preparaciones del neumocócica aislamiento natural mezclaron con el reactivo de aglutinación de látex que muestra una reacción positiva (A) o una reacción negativa (B). Aglutinación acompañado por compensación de los antecedentes se ve en la reacción positiva (A) es .There aglutinación no visible con el reactivo de control negativo o de látex en una reacción negativo de la prueba (B). Fotografías 8 usan con permiso.&quot;Target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Pruebas de aglutinación de látex es un método simple, rápido y barato para la serotipificación Streptococcus pneumoniae, y también ha sido ampliamente aplicada en microbiología de diagnóstico. Este manuscrito describe la producción interna de los reactivos de aglutinación de látex, procedimientos de control de calidad y la aplicación de esta técnica para la serotipificación neumocócica.

Capsular Serotipificación de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Por partículas de látex

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K vistas.  Murdoch Childrens Research Institute.  Pruebas de aglutinación de látex es un método simple, rápido y barato para la serotipificación Streptococcus pneumoniae, y también ha sido ampliamente aplicada en microbiología de diagnóstico. Este manuscrito describe la producción interna de los reactivos de aglutinación de látex, procedimientos de control de calidad y la aplicación de esta técnica para la serotipificación neumocócica. 

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Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imágenes de células vivas de Bacillus subtilis Y Streptococcus pneumoniae Automatizada utilizando Time-lapse microscopía

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

Vigilar los cambios en la polaridad de la membrana, membrana Integridad, e intracelular de iones concentraciones en<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Uso de tintes fluorescentes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

Capsular serotipificación de<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Uso de la Reacción Quellung

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonización vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Un modelo de neumonía en inmunocompetentes robusta roedores para evaluar Eficacia antibacteriana contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...