Name: capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination
Uploaded: 2014-09-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination at JoVE.com

This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1. إعداد في المنزل الكواشف مطاط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجلايسين مخزنة المالحة (GBS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 غرام الجلايسين، 11.7 جم كلوريد الصوديوم و 100 مل من الماء المقطر إلى كوب 200 مل دورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج بحل باستخدام محرك مغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخليط إلى 500 مل اسطوانة قياس وإضافة الماء المقطر لجعل ما مجموعه 200 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل إلى الدورق 200 مل، والتحقق من الرقم الهيدروجيني وضبط إلى 8.2 مع هيدروكسيد الصوديوم M 5. ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم هو تآكل، ارتداء معدات الوقاية الشخصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلتر تعقيم الحل باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر وعدة 60 مل المحاقن في زجاجة 250 مل preautoclaved المسمار المغطاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين في RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد GBS مع 0.2٪ ألبومين المصل البقري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.2 غرام من ألبومين المصل البقري (BSA) مسحوق و 100 مل من GBS إلى كوب 200 مل كوب وخلط بحل باستخدام محرك مغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلترتعقيم الحل من خلال 0.22 ميكرومتر مرشحات باستخدام عدة 60 مل مل المحاقن إلى preautoclaved المسمار زجاجة توج 250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزينها في 4 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد اللاتكس كاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية 2 مل جولة القاع microfuge أنبوب. ملاحظة: جولة وتستخدم أنابيب أسفل لتقليل ترسيب الجسيمات التي قد تؤثر على مرفق الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة P1000 مع نصائح عقيمة إضافة 975 ميكرولتر من GBS في microfuge أنبوب، ثم إضافة 25 ميكرولتر من مصل المكورات الرئوية المناسب للكاشف يجري إعداد اللاتكس (أي تجمع أو جماعة أو نوع أو عامل). عكس خمس مرات لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع جزيئات البوليستيرين اللاتكس 01:10 بإضافة 120 ميكرولتر من جزيئات اللاتكس إلى 1،080 ميكرولتر من المياه المالحة الفسيولوجية العقيمة. ملاحظة: هذا يمكن أن يتم في حجم أكبر، ولكن ينبغي بذل العذبة في كل مرة يتم إنتاج الكواشف اللاتكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1،000 ميكرولتر من تعليق 01:10 اللاتكس (المعد في الخطوة 1.3.3) إلى 1،000 ميكرولتر مصل 01:40 تعليق (المعد في الخطوة 1.3.2). عكس خمس مرات لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية على عجلة دوارة ببطء (على سبيل المثال، 4 دورة في الدقيقة لعجلة من 38.5 سم القطر) لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1،100 ز س. تجاهل طاف و resuspend بلطف بيليه في 2 مل من محلول ملحي معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1،100 ز س. تجاهل طاف وإضافة 1 مل من GBS و resuspend بلطف بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة تعليق اللاتكس إلى المسمى 5 مل المسمار توج الأنبوب. إضافة 1 مل أخرى من GBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من GBS تحتوي على 0.2٪ BSA (ث / ت) (8.2 درجة الحموضة) (المعد في الخطوة 1.2). إضافة 40 ميكرولتر من 10٪ (ث / ت) حل أزيد الصوديوم كمادة حافظة. ملاحظة: أزيد الصوديوم خطرة في حالة استنشاقه، وهو مهيج الجلد والعين. فمن المستحسن لشراء استعداد حل 10٪ بدلا من شكل مسحوق، وهذا يقلل من مخاطر التعرض للاستنشاق. معدات الحماية الشخصية (بما في ذلك القفازات ووينبغي ارتداء نظارات واقية د البداية) عند التعامل مع هذا كاشف. الرجوع إلى ورقة بيانات السلامة المادية للحصول على التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكواشف متجر اللاتكس في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سيطرة سلبية لاتكس كاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية 2 مل جولة القاع microfuge أنبوب. ملاحظة: جولة وتستخدم أنابيب أسفل لتقليل ترسيب الجسيمات التي قد تؤثر على مرفق الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة P1000 مع نصائح عقيمة إضافة 975 ميكرولتر من GBS في microfuge أنبوب، ثم إضافة 25 ميكرولتر مصل الأرنب العادي. عكس خمس مرات لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والمضي قدما في خطوات 1.3.3 إلى 1.3.10 فوق </li></ol></li></ol> 2. مراقبة الجودة (QC) من مطاط الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب اللاتكس كاشف لRT. فورا قبل الاستخدام، مزيج بلطف كاشف اللاتكس بواسطة قلب الأنبوب عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق كاشف للتراص ذاتي من قبل pipetting 15 ميكرولتر على شريحة المجهر والزجاج، وتابع كما في الخطوات 4.7 و 4.8 أدناه. يجب أن يكون هناك وgglutination من جزيئات اللاتكس. يجب أن تظهر كاشف بيضاء وناعمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار كاشف ضد فريق من مرور منخفض عزلات المكورات الرئوية. استخدام الثقافات نمت حديثا أعد كما في الخطوة 3. لوحة من العزلات ينبغي أن تشمل العزلات من &#39;الهدف&#39; النمط المصلي (النمط المصلي محدد للكاشف يجري اختبارها) والأنماط المصلية &quot;غير المستهدفة&quot; (العزلات من الأنماط المصلية الأخرى التي لا ينبغي عبور عادة تتفاعل مع كاشف). تشمل عزلة واحدة على الأقل من كل المستهدفة وغير المستهدفة المصلي لكل كاشف اللاتكس تمر QC. إذا كان هناك هدف أو المصلي غير المستهدفة، اختبار واحد فقط اثنين من عزلات مختلفة من النمط المصلي معين. ملاحظة: يجب أن تتضمن لوحة اختبار عدة عزلات من كل المصلي، بعضها شائع في مرض الغازية و / أو مجموعات نوع الثقافة. فمن الأفضل أن تشمل يعزل بعض النقل، كما أنها غالبا ما تكون أكثر تطلبا للالمصلي (لا تظهر البيانات)، وبالتالي زيادة اختبار قدرة سو الكواشف وضمان الكواشف قادرة على الأرجح من التصنيف المصلي سواء الغازية والنقل يعزل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في اختبار الكواشف اللاتكس مع الهدف والمكورات الرئوية غير المستهدفة يعزل حسب الطريقة الموضحة في الخطوات 3 و 4 أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكواشف لمراقبة الجودة في وقت الإنتاج ومن ثم على الأقل سنويا بعد ذلك. ملاحظة: إذا لم كاشف تمر QC، لا بد من التخلص منها دفعة وإعداد الجديدة مصنوعة. في حال عدم تكرار QC نوصي أن تنتج الكواشف باستخدام الطرق البديلة وصفها في Ortika وآخرون 2013 و8 في المناقشة أدناه. </li></ol> 3. التحضير للثقافات الرئوية للالمصلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حلقة عقيمة اختيار مستعمرة واحدة من المكورات الرئوية عزل وهذا متتالية من الصعود إلى أجار الدم اانتقائي الصلبة بحيث يغطي اللقاح الأولي حوالي ثلث سطح اللوحة. خط للمستعمرات واحدة. ملاحظة: لوحات أعدت من الحصان مزال الفبرين أو الأغنام الدم هي مناسبة؛ ولكن لوحات الدم أعدت مع دم الإنسان أو دم الحيوان سيتراتية ليست كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة O / N عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة النمو على لوحة للنقاء وتقييم أن هناك نمو كاف للالمصلي. ملاحظة: ثقافة نقية من عزل المكورات الرئوية مطلوب للالمصلي. في تجربتنا، متموجة، أو بالقرب متموجة النمو تغطي حوالي ثلث سطح لوحة عادة ما يكون كافيا لإكمال المصلي. كما ثقافات الرئوية قد تكون عرضة للانحلال ذاتي، يجب اختبار الثقافات التي أعدت لالمصلي خلال 24 ساعة من ثقافة فرعية. لا تأخذ لوحة الثقافة من الحاضنة أكثر من 15 إلى 20 دقيقة قبل أن يبدأ المصلي. </li></ol> 4. إجراء تراص اللاتكس المصلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع الكواشف اللاتكس من الثلاجة والسماح لهم نستريح لRT لحواليimately 30 دقيقة. فورا قبل الاستخدام، عكس بلطف أنابيب لخلط الكواشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية شريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 15 ميكرولتر من السيطرة سلبي اللاتكس كاشف على الشريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام العقيمة المتاح 1 ميكرولتر حلقة اتخاذ اكتساح الثقافة الرئوية بحيث تكون الحلقة ما يقرب من نصف كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشويه بلطف اللقاح على سطح الشريحة قريبة من قطرة سلبي السيطرة اللاتكس كاشف. يجب أن يكون اللقاح مرئية على شريحة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة وبدقة خلط اللقاح في السلبي كاشف السيطرة المطاط باستخدام حلقة. تأكد من أن انخفاض لا ينتشر إلى أبعد من حجمها الأولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الشريحة، وعقد في كلا الجانبين. صخرة الشريحة ذهابا وإيابا لمدة 1 دقيقة. العناية للحفاظ على السائل تتحرك ببطء، والتأكد من أن حجم الانخفاض لا يزيد. ملاحظة: بدلا من استخدام لوحة الروك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة لتراص العيانية (أي بواسطةبالعين المجردة) والمقاصة للتعليق على خلفية سوداء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا أظهر السلبي السيطرة اللاتكس كاشف لا تراص أو تستمر المقاصة اختبار الثقافة، لتحل محل الكواشف اختبار اللاتكس لمراقبة سلبي اللاتكس كاشف في الخطوات 4،1-4،8 أعلاه. يجب استخدام حلقة جديدة في كل مرة. المضي قدما في اختبار الكواشف اللاتكس بدءا من برك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار كل من &quot;بركة&quot; الكواشف اللاتكس في سلسلة متوالية حتى يتم الحصول على النتيجة الايجابية. ملاحظة: ترتيب اختبار يمكن أن يتم في &quot;جولات&quot; برك لتعكس حدوث المحلي من الأنماط المصلية معينة (على سبيل المثال، عن طريق اختبار لثلاثة حمامات الأرجح على الشريحة الأولى وإذا لم يتم الحصول على رد فعل إيجابي، ثم اختبار في اليوم التالي ثلاثة على الأرجح من حمامات المتبقية على الشريحة الثانية، وهلم جرا حتى يتم الحصول على رد فعل إيجابي). هذا يضمن أن الأنماط المصلية الأكثر شيوعا ويتم اختبار أولا، تقليل الوقت والكواشف اللازمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">باستخدام مفتاح الشركة المصنعة أمصال مضادة لتحديد أي أمصال مضادة فرد تتمثل في تجمع إيجابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار كل مجموعة من المجموعات أو الأنواع الواردة في تجمع إيجابي بشكل فردي لتحديد &#39;مجموعة&#39; أو &#39;نوع&#39; كما هو الحال في الخطوات 4،1-4،8 أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نتيجة بالرجوع إلى مفتاح الشركة المصنعة أمصال مضادة ل. إذا يتم تحديد &quot;نوع &#39;(على سبيل المثال، النمط المصلي 5)، ثم لا حاجة لمزيد من الاختبارات ويتم تسجيل هذه النتيجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا يتم تحديد &#39;المجموعة&#39; (على سبيل المثال، مجموعة 19)، ثم ترجع إلى مفتاح المصنعين لتحديد العوامل التي سيتم اختبارها. مواصلة التجارب الفردية مع &quot;عامل&quot; الكواشف اللاتكس وتحديد النمط المصلي النهائي (على سبيل المثال، 19B المصلي). </li></ol>

<ol>
	<li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010:+estimates+of+incidence,+severe+morbidity,+mortality,+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries.">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years:+global+estimates.">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li><li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae.">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li><li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease:+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use,+part+I.">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li><li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li><li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae:+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group.">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. , (2013).</li><li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping.">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li><li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003.">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li><li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+(Pneumotest-Latex).">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li><li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray.">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li><li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae.">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li><li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays:+a+cost-effective+technique+for+developing+countries.">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li><li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates.">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li><li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis.">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li><li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction.">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li><li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae.">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li><li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci.">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li><li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests.">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li><li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection.">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li><li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis.">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة لالمصلي المكورات الرئوية. هي المكورات الرئوية التجارية الكواشف تراص اللاتكس المتاحة، ولكنها حاليا لا تفرق عن المكورات الرئوية المعروفة الأنماط المصلية 10،12. ومع ذلك، لاتكس الكواشف تراص يمكن أن تنتج بسهولة في المنزل باستخدام أمصال مضادة شراؤها التي أثيرت ضد مستضدات معينة محفظية الرئوية. في الطريقة الموصوفة هنا، وترد بشكل سلبي الأجسام المضادة لجزيئات اللاتكس لجعل مجموعة من الكواشف تراص اللاتكس. يحدث رد فعل إيجابي عندما اللاتكس أجسام مضادة محددة منضمة إلى جزيئات اللاتكس نعلق على مستضدات على كبسولة السكاريد من المكورات الرئوية عزل 18،19. جزيئات اللاتكس تعلق على الأجسام المضادة تسمح ردة فعل معينة الضد مستضد أن تصور بدون تكبير. تراص اللاتكس هي طريقة مناسبة لمختبرات إنتاجية عالية ود أيضا للبيئات الفقيرة الموارد. المزايا الرئيسية لطريقة تراص اللاتكس هي ما هو مطلوب أي معدات متخصصة لأداء الاختبار، الكواشف لديها الصلاحية لا يقل عن 2 سنوات عند تخزينها في 4 درجات مئوية 8، وأنها غير مكلفة وبسيطة وسريعة لأداء. التصنيف المصلي لعزل المكورات الرئوية من تراص اللاتكس يستغرق حوالي 10 دقيقة، ويمكن اختبار ما يصل إلى أربعة الكواشف اللاتكس بالتوازي على شريحة واحدة. وعلاوة على ذلك، إذا كان من المعروف انتشار الأنماط المصلية لتحديد وبائية ذات الصلة، والاختبار لا يمكن أن يؤديها في جولات بدءا من أحواض تحتوي على الأنماط المصلية الأكثر شيوعا على غرار اختبار الانتباج 17. هذا النهج يقلل من عدد من الاختبارات اللازمة لتحديد النمط المصلي. هذه الطريقة أيضا تكرار للغاية بين المشغلين مختلفة (لا تظهر البيانات). عيوب تراص اللاتكس المصلي هو أن إنتاج الكواشف وقتا طويلا، مع حوالي 4 ساعة. على الرغم من الكواشف متعددةيمكن بسهولة أن تنتج اليلة بشكل متواز. وعلاوة على ذلك، بعض المضادات شائعة عبر الأنماط المصلية الرئوية المختلفة، مما أدى إلى ردود فعل عبر مع بعض أمصال مضادة (على سبيل المثال، النمط المصلي 29، 42 والمجموعة 35). ومع ذلك، تتميز هذه التفاعلات عبر جيدا عند استخدام أمصال مضادة التجاري (والتي عادة ما preabsorbed لإزالة الأجسام المضادة عبر التفاعل أكثر إشكالية) والجداول رد فعل إضافية يتم توفيرها من قبل الشركة المصنعة من أجل التمييز التي المصلي هو الحاضر. تتفاعل الكواشف اللاتكس قد تعبر أيضا إذا لم يتم محاذاة الأجسام المضادة بشكل صحيح على جزيئات اللاتكس. تم الكشف عن هذه الإخفاقات ومراقبة الجودة. في تجربتنا، QC صارمة أمر أساسي لنجاح هذه الطريقة، حتى عند استخدام أمصال مضادة المتاحة تجاريا للإنتاج. QC يستغرق حوالي 15 دقيقة لكل كاشف وتعتمد على مجموعة من العزلات QC المناسبة كما هو موضح أعلاه. الطريقة الموصوفة هنا النتائج في الكواشف التي تعطي رد فعل إيجابي جيدا وايرقيقة فترة الاختبار. في تجربتنا، وايجابيات كاذبة نادرة في الممارسة (لا تظهر البيانات). ويلاحظ ردود فعل سلبية كاذبة في بعض الأحيان. عادة ما تتصل هذه المشكلات المعروفة مع مصل معين (على سبيل المثال، الزمرة المصلية 6 العزلات قد لا تتفاعل مع تجمع مصل B)، أو تنظيم لأسفل من كبسولة التعبير من قبل عزل. باستخدام algrorithm التصنيف المصلي المقدمة من قبل الشركة المصنعة المهم أيضا، كما هو الحال في معظم الحالات رد فعل إيجابي أو سلبي كاذبة ستؤدي الى نتيجة &quot;نهاية عمياء&quot;. في هذه الحالات، وعندما يصعب تفسير ردود الفعل، ونحن نوصي تكرار الاختبار و / أو اختبار بواسطة طريقة بديلة مثل رد فعل الانتباج. مطلوب بعض المشاكل أحيانا إلى جعل الكواشف اللاتكس مرضية. في طريقة وصفها هنا، يتم إرفاق أجسام مضادة لجزيئات اللاتكس عبر الامتزاز السلبي 15،19، لذلك المتغير الحاسم هو تركيز الأجسام المضادة المستخدمة، والذي يحدد مدىيتم تغطية سطح جزيئات اللاتكس والمحاذاة لاحقة من الأجسام المضادة المواقع المفعلة 15،20. بالتالي، إذا تم إرفاق كافية أو الزائد الأجسام المضادة للجزيئات اللاتكس، ردود فعل الضد مستضد لن يكون الأمثل، ويمكن أن تنتج المواد الكيميائية غير مرضية 15،20،21. كما التتر الضد تختلف بين الكثير مختلفة من أمصال مضادة، مجموعة قياسية من التخفيفات قد لا تنتج الكواشف التي تحقق أداء جيدا 8. وهناك نقطة انطلاق مفيدة هو استخدام 01:40 التخفيف من مصل، وإذا لم يكن هذا بنجاح، يخفف من مصل أبعد من ذلك. في تجربتنا هذه عادة حل المشكلة 8. في عدد قليل من الحالات قد تظهر الكواشف ضعيفة تراص الذي لا يرافقه المقاصة لتعليق عند اختباره مع يعزل الهدف. في هذه الحالات تمييع مصل لا تحسين نوعية الكاشف، ولكن يمكن عادة أن تنتج الكواشف مرضية، بحذف الطرد المركزي وغسل الخطوات 8،22 </sup&gt;. وتستخدم الأجسام المضادة المغلفة الجسيمات اللاتكس عادة في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي للكشف وتحديد أو المصلي العديد من الميكروبات المختلفة 15،20. على هذا النحو، فإن الطريقة الموصوفة هنا قد تكون مناسبة لإعداد الكواشف اللاتكس لأغراض أخرى، شريطة أمصال مضادة مناسبة متاحة ويتم اعتماد إجراءات مراقبة الجودة الكافية.

العقدية الرئوية (المكورة الرئوية) هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في الأطفال دون سن الخامسة من العمر، وخاصة في البيئات الفقيرة بالموارد 1،2 في جميع أنحاء العالم. يتراوح مرض الالتهاب الرئوي من العدوى المحلية إلى الظروف التي تهدد الحياة مثل الالتهاب الرئوي والإنتان والتهاب السحايا 1،2. أكثر من 90 من الأنماط المصلية المكورات الرئوية تم تحديدها على أساس الاختلافات في السكاريد المحفظة الخاصة 3. اللقاحات الحالية تستهدف السكاريد المحفظة وتوفر الحماية من الأنماط المصلية الرئيسية المسببة للأمراض الغازية 4. التصنيف المصلي المكورات الرئوية المعزولة المهم لتقييم تأثير التطعيم على النقل والمرض وكذلك توفير المعلومات الوبائية أوسع نطاقا 5،6. الطريقة الحالية &quot;المعيار الذهبي&quot; لالمصلي المكورات الرئوية هو اختبار الانتباج، لكنها تستغرق وقتا طويلا ويتطلب بعض المهارة لperfoRM 7. تراص اللاتكس هو طريقة المصلي بديل أوصت بها منظمة الصحة العالمية 7. تراص اللاتكس هو سريعة وبسيطة لأداء، ويعمل في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم 8-11. الأهم من ذلك، وقد أظهرت تراص اللاتكس دقة مماثلة لاختبار الانتباج للالمصلي المكورات الرئوية 10،12-14. عموما، هذه الطريقة مثالية للبيئات الفقيرة الموارد وكذلك مختبرات إنتاجية عالية. يتم إنشاء الكواشف تراص اللاتكس (&#39;الكواشف اللاتكس&#39;) من المرفق من أجسام مضادة لجزيئات اللاتكس 15. في رد فعل إيجابي، هذه الجزيئات المسمى التصقت في وجود مستضد معين. تتوفر لمجموعة محدودة من الأنماط المصلية الكواشف اللاتكس التجارية. ويمكن أيضا الكواشف اللاتكس تكون مستعدة في المنزل باستخدام أمصال مضادة متاح تجاريا 10. خليط من أمصال مضادة (&#39;حمامات&#39;) وكذلك أمصال مضادة محددة لق المكورات الرئويةerogroups (على سبيل المثال، مجموعة 19)، الأنماط المصلية الفردية (مثل المصلي 5)، وإلى مستضدات محددة (&quot;العوامل&quot;، على سبيل المثال، عامل 19C الاعتراف المصلي 19A) متوفرة 16 لمزيد من تحديد الأنماط المصلية ضمن مجموعات. توضح هذه المخطوطة الخطوات الرئيسية في إنتاج الكواشف اللاتكس باستخدام التعلق السلبي للأمصال مضادة متاح تجاريا لجزيئات اللاتكس. ووصف مراقبة الجودة (QC) جوانب هذه الطريقة، ويتم تضمين بروتوكول لاستخدام الكواشف اللاتكس لالمصلي المكورات الرئوية.

<table><tbody><tr><td>Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>Or other volumes as required</td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Antibodies Australia&amp;nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>Or other volumes as required, bring to RT before use</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) antisera</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Various</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Bring to rRT before use</td></tr><tr><td>Sodium azide 10% (v/v) solution&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Round bottom</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Calibrated disposable inoculating loops 1 &amp;micro;l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Caution: highly corrosive</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Horse Blood Agar (HBA) plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com.au/&quot;&gt;http://www.thermofisher.com.au&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Rotating wheel</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringes without needles</td><td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Brochure on Neufeld antisera</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Key to determining serotypes&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Key to pneumococcal factor serum</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>For determining serotype within Groups&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>*alternative sources are available for most materials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

يحدث رد فعل إيجابي لاتكس عند نوع معين الأجسام المضادة التي تعلق على الجسيمات اللاتكس بربط كبسولة من المكورات الرئوية، وتراص من الأجسام المضادة المسماة جزيئات تستتبعه 15. يبين الشكل 1A رد فعل إيجابي التي تتميز تراص مرئية والمقاصة من الخلفية تعليق. ويتسم رد فعل سلبي من قبل تراص اللاتكس كاشف تعليق المتبقية على نحو سلس والأبيض (الشكل 1B). هي الأمثل الكواشف بحيث ينبغي مراعاة رد فعل إيجابي قبل نهاية الفاصل الزمني دقيقة واحدة (عادة اكتشافها في حوالي 20 ثانية). لا نوصي قراءة ردود الفعل بعد الفاصل الزمني 1 دقيقة. أحيانا جدا، عرض ردود الفعل الضعيف تراص حول حافة الهبوط الذي لا يرافقه تطهير لتعليق الخلفية، أو تظهر &quot;مفتول العضلات&quot; مع عدم وجود خلفية المقاصة (لا تظهر البيانات). هذه هي الأكثر مثل<html> لاي ردود فعل سلبية. في مثل هذه الحالات، من المستحسن إعادة الاختبار و / أو إجراء مزيد من التحقيقات باستخدام طريقة أخرى المصلي (على سبيل المثال رد فعل الانتباج 17). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1. ردود الفعل تراص اللاتكس الإيجابية والسلبية. محضرات من المكورات الرئوية عزلها مختلطة مع تراص اللاتكس كاشف يظهر رد فعل إيجابي (A) أو رد فعل سلبي (B). ويعتبر تراص يرافقه المقاصة من الخلفية في رد فعل إيجابي (A) وليس هناك تراص مرئية السلبي مع سيطرة اللاتكس كاشف أو في اختبار رد فعل سلبي (B). الصور 8 تستخدم مع إذن.&quot;الهدف =&quot; _ على بياض &quot;&gt; الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination at JoVE.com

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

اختبار تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة للالتصنيف المصلي العقدية الرئوية، وكما تم تطبيقها على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي. تصف هذه المخطوطة إنتاج في المنزل من الكواشف تراص اللاتكس، وإجراءات مراقبة الجودة وتطبيق هذه التقنية لالمصلي المكورات الرئوية.

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; من جانب تراص اللاتكس

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K Views.  Murdoch Childrens Research Institute.  اختبار تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة للالتصنيف المصلي العقدية الرئوية، وكما تم تطبيقها على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي. تصف هذه المخطوطة إنتاج في المنزل من الكواشف تراص اللاتكس، وإجراءات مراقبة الجودة و...

Video: Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Biochemistry

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

التجريبية النقل المكورات الرئوية الإنسان

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Medicine

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; باستخدام تفاعل الانتباج

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

التصور<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; داخل القلب Microlesions وإعادة عرض القلب لاحقا

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new protein functions or to have access to protein conjugates. Stop codon suppression, in particular amber codon suppression, has emerged as the most popular method to genetically introduce UAAs at defined positions. This methodology is herein applied to the preparation of a carrier protein containing an UAA harboring a bioorthogonal functional group. This reactive handle can next be used to specifically and efficiently graft a synthetic oligosaccharide hapten to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine. The protocol is limited to the synthesis of glycoconjugates in a 1:1 carbohydrate hapten/carrier protein ratio but amenable to numerous pairs of biorthogonal functional groups. Glycococonjugate vaccine homogeneity is an important criterion to ensure complete physico-chemical characterization, thereby, satisfying more and more demanding drug regulatory agency recommendations, a criterion which is unmet by classical conjugation strategies. Moreover, this protocol makes it possible to finely tune the structure of the actual conjugate vaccine, giving rise to tools to address structure-immunogenicity relationships.

Genetic code expansion is applied for the introduction of an unnatural amino acid bearing a biorthogonal functional group on a carrier protein at a defined site. The biorthogonal function is further used for the site-selective coupling of a carbohydrate antigen to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine.

متجانسة جليكوكونجوجيت التي تنتجها الجمع بين دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية وكليك الكيمياء لأغراض لقاح

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Bioengineering

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

Opsono- الالتزام بـ اختبار لتقييم الأجسام المضادة الوظيفية في تطوير اللقاح ضد عصيات الجمرة الخبيثة وغيرها من مسببات الأمراض المغلفة

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

بناء الطفرات في سلالة العقدية الرئوية من النمط المصلي 1 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

المحفظة المصلي من

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video