This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

1. إعداد في المنزل الكواشف مطاط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجلايسين مخزنة المالحة (GBS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 غرام الجلايسين، 11.7 جم كلوريد الصوديوم و 100 مل من الماء المقطر إلى كوب 200 مل دورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج بحل باستخدام محرك مغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخليط إلى 500 مل اسطوانة قياس وإضافة الماء المقطر لجعل ما مجموعه 200 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل إلى الدورق 200 مل، والتحقق من الرقم الهيدروجيني وضبط إلى 8.2 مع هيدروكسيد الصوديوم M 5. ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم هو تآكل، ارتداء معدات الوقاية الشخصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلتر تعقيم الحل باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر وعدة 60 مل المحاقن في زجاجة 250 مل preautoclaved المسمار المغطاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين في RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد GBS مع 0.2٪ ألبومين المصل البقري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.2 غرام من ألبومين المصل البقري (BSA) مسحوق و 100 مل من GBS إلى كوب 200 مل كوب وخلط بحل باستخدام محرك مغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلترتعقيم الحل من خلال 0.22 ميكرومتر مرشحات باستخدام عدة 60 مل مل المحاقن إلى preautoclaved المسمار زجاجة توج 250. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزينها في 4 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد اللاتكس كاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية 2 مل جولة القاع microfuge أنبوب. ملاحظة: جولة وتستخدم أنابيب أسفل لتقليل ترسيب الجسيمات التي قد تؤثر على مرفق الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة P1000 مع نصائح عقيمة إضافة 975 ميكرولتر من GBS في microfuge أنبوب، ثم إضافة 25 ميكرولتر من مصل المكورات الرئوية المناسب للكاشف يجري إعداد اللاتكس (أي تجمع أو جماعة أو نوع أو عامل). عكس خمس مرات لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع جزيئات البوليستيرين اللاتكس 01:10 بإضافة 120 ميكرولتر من جزيئات اللاتكس إلى 1،080 ميكرولتر من المياه المالحة الفسيولوجية العقيمة. ملاحظة: هذا يمكن أن يتم في حجم أكبر، ولكن ينبغي بذل العذبة في كل مرة يتم إنتاج الكواشف اللاتكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1،000 ميكرولتر من تعليق 01:10 اللاتكس (المعد في الخطوة 1.3.3) إلى 1،000 ميكرولتر مصل 01:40 تعليق (المعد في الخطوة 1.3.2). عكس خمس مرات لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية على عجلة دوارة ببطء (على سبيل المثال، 4 دورة في الدقيقة لعجلة من 38.5 سم القطر) لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1،100 ز س. تجاهل طاف و resuspend بلطف بيليه في 2 مل من محلول ملحي معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1،100 ز س. تجاهل طاف وإضافة 1 مل من GBS و resuspend بلطف بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة تعليق اللاتكس إلى المسمى 5 مل المسمار توج الأنبوب. إضافة 1 مل أخرى من GBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من GBS تحتوي على 0.2٪ BSA (ث / ت) (8.2 درجة الحموضة) (المعد في الخطوة 1.2). إضافة 40 ميكرولتر من 10٪ (ث / ت) حل أزيد الصوديوم كمادة حافظة. ملاحظة: أزيد الصوديوم خطرة في حالة استنشاقه، وهو مهيج الجلد والعين. فمن المستحسن لشراء استعداد حل 10٪ بدلا من شكل مسحوق، وهذا يقلل من مخاطر التعرض للاستنشاق. معدات الحماية الشخصية (بما في ذلك القفازات ووينبغي ارتداء نظارات واقية د البداية) عند التعامل مع هذا كاشف. الرجوع إلى ورقة بيانات السلامة المادية للحصول على التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكواشف متجر اللاتكس في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سيطرة سلبية لاتكس كاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية 2 مل جولة القاع microfuge أنبوب. ملاحظة: جولة وتستخدم أنابيب أسفل لتقليل ترسيب الجسيمات التي قد تؤثر على مرفق الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة P1000 مع نصائح عقيمة إضافة 975 ميكرولتر من GBS في microfuge أنبوب، ثم إضافة 25 ميكرولتر مصل الأرنب العادي. عكس خمس مرات لخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والمضي قدما في خطوات 1.3.3 إلى 1.3.10 فوق </li></ol></li></ol> 2. مراقبة الجودة (QC) من مطاط الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب اللاتكس كاشف لRT. فورا قبل الاستخدام، مزيج بلطف كاشف اللاتكس بواسطة قلب الأنبوب عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق كاشف للتراص ذاتي من قبل pipetting 15 ميكرولتر على شريحة المجهر والزجاج، وتابع كما في الخطوات 4.7 و 4.8 أدناه. يجب أن يكون هناك وgglutination من جزيئات اللاتكس. يجب أن تظهر كاشف بيضاء وناعمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار كاشف ضد فريق من مرور منخفض عزلات المكورات الرئوية. استخدام الثقافات نمت حديثا أعد كما في الخطوة 3. لوحة من العزلات ينبغي أن تشمل العزلات من &#39;الهدف&#39; النمط المصلي (النمط المصلي محدد للكاشف يجري اختبارها) والأنماط المصلية &quot;غير المستهدفة&quot; (العزلات من الأنماط المصلية الأخرى التي لا ينبغي عبور عادة تتفاعل مع كاشف). تشمل عزلة واحدة على الأقل من كل المستهدفة وغير المستهدفة المصلي لكل كاشف اللاتكس تمر QC. إذا كان هناك هدف أو المصلي غير المستهدفة، اختبار واحد فقط اثنين من عزلات مختلفة من النمط المصلي معين. ملاحظة: يجب أن تتضمن لوحة اختبار عدة عزلات من كل المصلي، بعضها شائع في مرض الغازية و / أو مجموعات نوع الثقافة. فمن الأفضل أن تشمل يعزل بعض النقل، كما أنها غالبا ما تكون أكثر تطلبا للالمصلي (لا تظهر البيانات)، وبالتالي زيادة اختبار قدرة سو الكواشف وضمان الكواشف قادرة على الأرجح من التصنيف المصلي سواء الغازية والنقل يعزل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في اختبار الكواشف اللاتكس مع الهدف والمكورات الرئوية غير المستهدفة يعزل حسب الطريقة الموضحة في الخطوات 3 و 4 أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكواشف لمراقبة الجودة في وقت الإنتاج ومن ثم على الأقل سنويا بعد ذلك. ملاحظة: إذا لم كاشف تمر QC، لا بد من التخلص منها دفعة وإعداد الجديدة مصنوعة. في حال عدم تكرار QC نوصي أن تنتج الكواشف باستخدام الطرق البديلة وصفها في Ortika وآخرون 2013 و8 في المناقشة أدناه. </li></ol> 3. التحضير للثقافات الرئوية للالمصلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حلقة عقيمة اختيار مستعمرة واحدة من المكورات الرئوية عزل وهذا متتالية من الصعود إلى أجار الدم اانتقائي الصلبة بحيث يغطي اللقاح الأولي حوالي ثلث سطح اللوحة. خط للمستعمرات واحدة. ملاحظة: لوحات أعدت من الحصان مزال الفبرين أو الأغنام الدم هي مناسبة؛ ولكن لوحات الدم أعدت مع دم الإنسان أو دم الحيوان سيتراتية ليست كذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة O / N عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة النمو على لوحة للنقاء وتقييم أن هناك نمو كاف للالمصلي. ملاحظة: ثقافة نقية من عزل المكورات الرئوية مطلوب للالمصلي. في تجربتنا، متموجة، أو بالقرب متموجة النمو تغطي حوالي ثلث سطح لوحة عادة ما يكون كافيا لإكمال المصلي. كما ثقافات الرئوية قد تكون عرضة للانحلال ذاتي، يجب اختبار الثقافات التي أعدت لالمصلي خلال 24 ساعة من ثقافة فرعية. لا تأخذ لوحة الثقافة من الحاضنة أكثر من 15 إلى 20 دقيقة قبل أن يبدأ المصلي. </li></ol> 4. إجراء تراص اللاتكس المصلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع الكواشف اللاتكس من الثلاجة والسماح لهم نستريح لRT لحواليimately 30 دقيقة. فورا قبل الاستخدام، عكس بلطف أنابيب لخلط الكواشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية شريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 15 ميكرولتر من السيطرة سلبي اللاتكس كاشف على الشريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام العقيمة المتاح 1 ميكرولتر حلقة اتخاذ اكتساح الثقافة الرئوية بحيث تكون الحلقة ما يقرب من نصف كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشويه بلطف اللقاح على سطح الشريحة قريبة من قطرة سلبي السيطرة اللاتكس كاشف. يجب أن يكون اللقاح مرئية على شريحة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسرعة وبدقة خلط اللقاح في السلبي كاشف السيطرة المطاط باستخدام حلقة. تأكد من أن انخفاض لا ينتشر إلى أبعد من حجمها الأولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الشريحة، وعقد في كلا الجانبين. صخرة الشريحة ذهابا وإيابا لمدة 1 دقيقة. العناية للحفاظ على السائل تتحرك ببطء، والتأكد من أن حجم الانخفاض لا يزيد. ملاحظة: بدلا من استخدام لوحة الروك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة لتراص العيانية (أي بواسطةبالعين المجردة) والمقاصة للتعليق على خلفية سوداء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا أظهر السلبي السيطرة اللاتكس كاشف لا تراص أو تستمر المقاصة اختبار الثقافة، لتحل محل الكواشف اختبار اللاتكس لمراقبة سلبي اللاتكس كاشف في الخطوات 4،1-4،8 أعلاه. يجب استخدام حلقة جديدة في كل مرة. المضي قدما في اختبار الكواشف اللاتكس بدءا من برك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار كل من &quot;بركة&quot; الكواشف اللاتكس في سلسلة متوالية حتى يتم الحصول على النتيجة الايجابية. ملاحظة: ترتيب اختبار يمكن أن يتم في &quot;جولات&quot; برك لتعكس حدوث المحلي من الأنماط المصلية معينة (على سبيل المثال، عن طريق اختبار لثلاثة حمامات الأرجح على الشريحة الأولى وإذا لم يتم الحصول على رد فعل إيجابي، ثم اختبار في اليوم التالي ثلاثة على الأرجح من حمامات المتبقية على الشريحة الثانية، وهلم جرا حتى يتم الحصول على رد فعل إيجابي). هذا يضمن أن الأنماط المصلية الأكثر شيوعا ويتم اختبار أولا، تقليل الوقت والكواشف اللازمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">باستخدام مفتاح الشركة المصنعة أمصال مضادة لتحديد أي أمصال مضادة فرد تتمثل في تجمع إيجابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار كل مجموعة من المجموعات أو الأنواع الواردة في تجمع إيجابي بشكل فردي لتحديد &#39;مجموعة&#39; أو &#39;نوع&#39; كما هو الحال في الخطوات 4،1-4،8 أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نتيجة بالرجوع إلى مفتاح الشركة المصنعة أمصال مضادة ل. إذا يتم تحديد &quot;نوع &#39;(على سبيل المثال، النمط المصلي 5)، ثم لا حاجة لمزيد من الاختبارات ويتم تسجيل هذه النتيجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا يتم تحديد &#39;المجموعة&#39; (على سبيل المثال، مجموعة 19)، ثم ترجع إلى مفتاح المصنعين لتحديد العوامل التي سيتم اختبارها. مواصلة التجارب الفردية مع &quot;عامل&quot; الكواشف اللاتكس وتحديد النمط المصلي النهائي (على سبيل المثال، 19B المصلي). </li></ol>

<ol>
	<li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010:+estimates+of+incidence,+severe+morbidity,+mortality,+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries.">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years:+global+estimates.">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li><li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae.">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li><li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease:+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use,+part+I.">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li><li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li><li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae:+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group.">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. , (2013).</li><li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping.">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li><li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003.">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li><li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+(Pneumotest-Latex).">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li><li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray.">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li><li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae.">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li><li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays:+a+cost-effective+technique+for+developing+countries.">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li><li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates.">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li><li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis.">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li><li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction.">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li><li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae.">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li><li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci.">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li><li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests.">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li><li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection.">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li><li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis.">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة لالمصلي المكورات الرئوية. هي المكورات الرئوية التجارية الكواشف تراص اللاتكس المتاحة، ولكنها حاليا لا تفرق عن المكورات الرئوية المعروفة الأنماط المصلية 10،12. ومع ذلك، لاتكس الكواشف تراص يمكن أن تنتج بسهولة في المنزل باستخدام أمصال مضادة شراؤها التي أثيرت ضد مستضدات معينة محفظية الرئوية. في الطريقة الموصوفة هنا، وترد بشكل سلبي الأجسام المضادة لجزيئات اللاتكس لجعل مجموعة من الكواشف تراص اللاتكس. يحدث رد فعل إيجابي عندما اللاتكس أجسام مضادة محددة منضمة إلى جزيئات اللاتكس نعلق على مستضدات على كبسولة السكاريد من المكورات الرئوية عزل 18،19. جزيئات اللاتكس تعلق على الأجسام المضادة تسمح ردة فعل معينة الضد مستضد أن تصور بدون تكبير. تراص اللاتكس هي طريقة مناسبة لمختبرات إنتاجية عالية ود أيضا للبيئات الفقيرة الموارد. المزايا الرئيسية لطريقة تراص اللاتكس هي ما هو مطلوب أي معدات متخصصة لأداء الاختبار، الكواشف لديها الصلاحية لا يقل عن 2 سنوات عند تخزينها في 4 درجات مئوية 8، وأنها غير مكلفة وبسيطة وسريعة لأداء. التصنيف المصلي لعزل المكورات الرئوية من تراص اللاتكس يستغرق حوالي 10 دقيقة، ويمكن اختبار ما يصل إلى أربعة الكواشف اللاتكس بالتوازي على شريحة واحدة. وعلاوة على ذلك، إذا كان من المعروف انتشار الأنماط المصلية لتحديد وبائية ذات الصلة، والاختبار لا يمكن أن يؤديها في جولات بدءا من أحواض تحتوي على الأنماط المصلية الأكثر شيوعا على غرار اختبار الانتباج 17. هذا النهج يقلل من عدد من الاختبارات اللازمة لتحديد النمط المصلي. هذه الطريقة أيضا تكرار للغاية بين المشغلين مختلفة (لا تظهر البيانات). عيوب تراص اللاتكس المصلي هو أن إنتاج الكواشف وقتا طويلا، مع حوالي 4 ساعة. على الرغم من الكواشف متعددةيمكن بسهولة أن تنتج اليلة بشكل متواز. وعلاوة على ذلك، بعض المضادات شائعة عبر الأنماط المصلية الرئوية المختلفة، مما أدى إلى ردود فعل عبر مع بعض أمصال مضادة (على سبيل المثال، النمط المصلي 29، 42 والمجموعة 35). ومع ذلك، تتميز هذه التفاعلات عبر جيدا عند استخدام أمصال مضادة التجاري (والتي عادة ما preabsorbed لإزالة الأجسام المضادة عبر التفاعل أكثر إشكالية) والجداول رد فعل إضافية يتم توفيرها من قبل الشركة المصنعة من أجل التمييز التي المصلي هو الحاضر. تتفاعل الكواشف اللاتكس قد تعبر أيضا إذا لم يتم محاذاة الأجسام المضادة بشكل صحيح على جزيئات اللاتكس. تم الكشف عن هذه الإخفاقات ومراقبة الجودة. في تجربتنا، QC صارمة أمر أساسي لنجاح هذه الطريقة، حتى عند استخدام أمصال مضادة المتاحة تجاريا للإنتاج. QC يستغرق حوالي 15 دقيقة لكل كاشف وتعتمد على مجموعة من العزلات QC المناسبة كما هو موضح أعلاه. الطريقة الموصوفة هنا النتائج في الكواشف التي تعطي رد فعل إيجابي جيدا وايرقيقة فترة الاختبار. في تجربتنا، وايجابيات كاذبة نادرة في الممارسة (لا تظهر البيانات). ويلاحظ ردود فعل سلبية كاذبة في بعض الأحيان. عادة ما تتصل هذه المشكلات المعروفة مع مصل معين (على سبيل المثال، الزمرة المصلية 6 العزلات قد لا تتفاعل مع تجمع مصل B)، أو تنظيم لأسفل من كبسولة التعبير من قبل عزل. باستخدام algrorithm التصنيف المصلي المقدمة من قبل الشركة المصنعة المهم أيضا، كما هو الحال في معظم الحالات رد فعل إيجابي أو سلبي كاذبة ستؤدي الى نتيجة &quot;نهاية عمياء&quot;. في هذه الحالات، وعندما يصعب تفسير ردود الفعل، ونحن نوصي تكرار الاختبار و / أو اختبار بواسطة طريقة بديلة مثل رد فعل الانتباج. مطلوب بعض المشاكل أحيانا إلى جعل الكواشف اللاتكس مرضية. في طريقة وصفها هنا، يتم إرفاق أجسام مضادة لجزيئات اللاتكس عبر الامتزاز السلبي 15،19، لذلك المتغير الحاسم هو تركيز الأجسام المضادة المستخدمة، والذي يحدد مدىيتم تغطية سطح جزيئات اللاتكس والمحاذاة لاحقة من الأجسام المضادة المواقع المفعلة 15،20. بالتالي، إذا تم إرفاق كافية أو الزائد الأجسام المضادة للجزيئات اللاتكس، ردود فعل الضد مستضد لن يكون الأمثل، ويمكن أن تنتج المواد الكيميائية غير مرضية 15،20،21. كما التتر الضد تختلف بين الكثير مختلفة من أمصال مضادة، مجموعة قياسية من التخفيفات قد لا تنتج الكواشف التي تحقق أداء جيدا 8. وهناك نقطة انطلاق مفيدة هو استخدام 01:40 التخفيف من مصل، وإذا لم يكن هذا بنجاح، يخفف من مصل أبعد من ذلك. في تجربتنا هذه عادة حل المشكلة 8. في عدد قليل من الحالات قد تظهر الكواشف ضعيفة تراص الذي لا يرافقه المقاصة لتعليق عند اختباره مع يعزل الهدف. في هذه الحالات تمييع مصل لا تحسين نوعية الكاشف، ولكن يمكن عادة أن تنتج الكواشف مرضية، بحذف الطرد المركزي وغسل الخطوات 8،22 </sup&gt;. وتستخدم الأجسام المضادة المغلفة الجسيمات اللاتكس عادة في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي للكشف وتحديد أو المصلي العديد من الميكروبات المختلفة 15،20. على هذا النحو، فإن الطريقة الموصوفة هنا قد تكون مناسبة لإعداد الكواشف اللاتكس لأغراض أخرى، شريطة أمصال مضادة مناسبة متاحة ويتم اعتماد إجراءات مراقبة الجودة الكافية.

العقدية الرئوية (المكورة الرئوية) هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في الأطفال دون سن الخامسة من العمر، وخاصة في البيئات الفقيرة بالموارد 1،2 في جميع أنحاء العالم. يتراوح مرض الالتهاب الرئوي من العدوى المحلية إلى الظروف التي تهدد الحياة مثل الالتهاب الرئوي والإنتان والتهاب السحايا 1،2. أكثر من 90 من الأنماط المصلية المكورات الرئوية تم تحديدها على أساس الاختلافات في السكاريد المحفظة الخاصة 3. اللقاحات الحالية تستهدف السكاريد المحفظة وتوفر الحماية من الأنماط المصلية الرئيسية المسببة للأمراض الغازية 4. التصنيف المصلي المكورات الرئوية المعزولة المهم لتقييم تأثير التطعيم على النقل والمرض وكذلك توفير المعلومات الوبائية أوسع نطاقا 5،6. الطريقة الحالية &quot;المعيار الذهبي&quot; لالمصلي المكورات الرئوية هو اختبار الانتباج، لكنها تستغرق وقتا طويلا ويتطلب بعض المهارة لperfoRM 7. تراص اللاتكس هو طريقة المصلي بديل أوصت بها منظمة الصحة العالمية 7. تراص اللاتكس هو سريعة وبسيطة لأداء، ويعمل في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم 8-11. الأهم من ذلك، وقد أظهرت تراص اللاتكس دقة مماثلة لاختبار الانتباج للالمصلي المكورات الرئوية 10،12-14. عموما، هذه الطريقة مثالية للبيئات الفقيرة الموارد وكذلك مختبرات إنتاجية عالية. يتم إنشاء الكواشف تراص اللاتكس (&#39;الكواشف اللاتكس&#39;) من المرفق من أجسام مضادة لجزيئات اللاتكس 15. في رد فعل إيجابي، هذه الجزيئات المسمى التصقت في وجود مستضد معين. تتوفر لمجموعة محدودة من الأنماط المصلية الكواشف اللاتكس التجارية. ويمكن أيضا الكواشف اللاتكس تكون مستعدة في المنزل باستخدام أمصال مضادة متاح تجاريا 10. خليط من أمصال مضادة (&#39;حمامات&#39;) وكذلك أمصال مضادة محددة لق المكورات الرئويةerogroups (على سبيل المثال، مجموعة 19)، الأنماط المصلية الفردية (مثل المصلي 5)، وإلى مستضدات محددة (&quot;العوامل&quot;، على سبيل المثال، عامل 19C الاعتراف المصلي 19A) متوفرة 16 لمزيد من تحديد الأنماط المصلية ضمن مجموعات. توضح هذه المخطوطة الخطوات الرئيسية في إنتاج الكواشف اللاتكس باستخدام التعلق السلبي للأمصال مضادة متاح تجاريا لجزيئات اللاتكس. ووصف مراقبة الجودة (QC) جوانب هذه الطريقة، ويتم تضمين بروتوكول لاستخدام الكواشف اللاتكس لالمصلي المكورات الرئوية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1085">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:263px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:299px;">Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">65984-10 ml-F</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:180px;">Antibodies Australia&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NRS-1ml</td>
			<td style="width:263px;">Or other volumes as required, bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:299px;">Pneumococcus (Neufeld) antisera</td>
			<td style="width:180px;">SSI Diagnostica</td>
			<td style="width:127px;">Various</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sterile Bovine Albumin&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">A-4503</td>
			<td style="width:263px;">Bring to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:299px;">Sodium azide 10% (v/v) solution&#160;</td>
			<td style="width:180px;">VWR International</td>
			<td style="width:127px;">ROAC3902/100ml</td>
			<td style="width:263px;">Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:127px;">0030 120.094</td>
			<td style="width:263px;">Round bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10241.AP</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Calibrated disposable inoculating loops 1 &#181;l</td>
			<td style="width:180px;">Copan</td>
			<td style="width:127px;">CD175SO1</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:299px;">Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">LBS 2950RC</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">5 M NaOH</td>
			<td style="width:180px;">BDH</td>
			<td style="width:127px;">10252</td>
			<td style="width:263px;">Caution: highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glycine</td>
			<td style="width:180px;">Merck</td>
			<td style="width:127px;">10119.05</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Horse Blood Agar (HBA) plates</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">PP2001</td>
			<td>Bring to room temperature before use 
			<a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Rotating wheel</td>
			<td style="width:180px;">Wyble Engineering Development Corporation</td>
			<td style="width:127px;">Not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:299px;">Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td>
			<td style="width:180px;">Technoplas</td>
			<td style="width:127px;">S5016SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">60 ml syringes without needles</td>
			<td style="width:180px;">Terumo</td>
			<td style="width:127px;">SS-60L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:180px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:127px;">SLGP033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Brochure on Neufeld antisera</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td>Key to determining serotypes 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Key to pneumococcal factor serum</td>
			<td style="width:180px;">Statens Serum Institut</td>
			<td align="right" style="width:127px;">18058</td>
			<td style="width:263px;">For determining serotype within Groups 
			<a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">*alternative sources are available for most materials</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

يحدث رد فعل إيجابي لاتكس عند نوع معين الأجسام المضادة التي تعلق على الجسيمات اللاتكس بربط كبسولة من المكورات الرئوية، وتراص من الأجسام المضادة المسماة جزيئات تستتبعه 15. يبين الشكل 1A رد فعل إيجابي التي تتميز تراص مرئية والمقاصة من الخلفية تعليق. ويتسم رد فعل سلبي من قبل تراص اللاتكس كاشف تعليق المتبقية على نحو سلس والأبيض (الشكل 1B). هي الأمثل الكواشف بحيث ينبغي مراعاة رد فعل إيجابي قبل نهاية الفاصل الزمني دقيقة واحدة (عادة اكتشافها في حوالي 20 ثانية). لا نوصي قراءة ردود الفعل بعد الفاصل الزمني 1 دقيقة. أحيانا جدا، عرض ردود الفعل الضعيف تراص حول حافة الهبوط الذي لا يرافقه تطهير لتعليق الخلفية، أو تظهر &quot;مفتول العضلات&quot; مع عدم وجود خلفية المقاصة (لا تظهر البيانات). هذه هي الأكثر مثل<html> لاي ردود فعل سلبية. في مثل هذه الحالات، من المستحسن إعادة الاختبار و / أو إجراء مزيد من التحقيقات باستخدام طريقة أخرى المصلي (على سبيل المثال رد فعل الانتباج 17). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1. ردود الفعل تراص اللاتكس الإيجابية والسلبية. محضرات من المكورات الرئوية عزلها مختلطة مع تراص اللاتكس كاشف يظهر رد فعل إيجابي (A) أو رد فعل سلبي (B). ويعتبر تراص يرافقه المقاصة من الخلفية في رد فعل إيجابي (A) وليس هناك تراص مرئية السلبي مع سيطرة اللاتكس كاشف أو في اختبار رد فعل سلبي (B). الصور 8 تستخدم مع إذن.&quot;الهدف =&quot; _ على بياض &quot;&gt; الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination at JoVE.com

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

اختبار تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة للالتصنيف المصلي العقدية الرئوية، وكما تم تطبيقها على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي. تصف هذه المخطوطة إنتاج في المنزل من الكواشف تراص اللاتكس، وإجراءات مراقبة الجودة وتطبيق هذه التقنية لالمصلي المكورات الرئوية.

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; من جانب تراص اللاتكس

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K Views.  Murdoch Childrens Research Institute.  اختبار تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة للالتصنيف المصلي العقدية الرئوية، وكما تم تطبيقها على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي. تصف هذه المخطوطة إنتاج في المنزل من الكواشف تراص اللاتكس، وإجراءات مراقبة الجودة و...

Video: Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

رصد التغيرات في غشاء التقاطب، غشاء النزاهة، وبين الخلايا ايون التركيزات في<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; استخدام الأصباغ نيون

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; باستخدام تفاعل الانتباج

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

البروتين من التنميط الضامة التي كتبها 2D الكهربائي

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em&gt; العقدية iniae</em&gt; العدوى

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

نموذج الفئران من المجموعة الثانية<em&gt; العقدية</em&gt; المهبلية الاستعمار

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

نموذج الالتهاب الرئوي القوي في مناعيا القوارض لتقييم مضاد للبكتيريا فعالية ضد<i&gt; S. الرئوية</i&gt;،<i&gt; H. النزلية</i&gt;،<i&gt; K. الرئوية</i&gt;،<em&gt; P. الزنجارية</em&gt; أو<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...