この方法は、細胞および組織に存在するmRNAを利用して、遺伝子の活性を積極的に緩やかにする方法などの重要な質問に答えるのに役立ちます。活動の欠陥を補償する方法、およびインビボおよびインビボでmRNAからの高い翻訳を達成する方法。この技術の主な利点は、固定および収集なしでイメージングすることによって、生きている細胞におけるSINEUPの標的遺伝子をグローバルにスクリーニングできることです。
したがって、この技術の影響は、SINEUPがフリードリヒの運動失調の場合にフラタキシンなどの欠乏タンパク質の2倍の増加を誘発することができるので、ハプロ不十分なインスタンスの治療にも及びます。まず、Zenbuブラウザを開き、目的のFantomプロジェクトデータベースをクリックします。標的遺伝子を探索し、所望の細胞および組織における転写開始部位、またはTSS、および発現量をチェックする。
TSSを決定するには、パーキンソン病タンパク質7またはPARK7 mRNAのサンプル分析を参照してください。ケージピーク領域別に TSS を確認します。細胞および組織特異的転写発現レベルを決定するには、ケージピーク領域を選択し、選択するゲノム領域を拡大してクリックします。
関心のある細胞および組織タイプにおけるPARK7発現を、ページの下部にある転写発現リストを探索して確認する。次に、40塩基上流に対応するいくつかの異なる長さの結合ドメイン配列を設計し、第1のメチオニンまたはAUGの下流に32塩基を有する。SINEPsでトランスフェクションする前に、2つのポリ-d-リジンに関心のある種子細胞が24のウェルプレートをコーティングした。
5%のCO2インキュベーターで摂氏37度で24時間インキュベートし、70%の合流を達成します。ウェル内で細胞を均等に分配することが非常に重要であり、この目的のために、クリーンベンチ内に細胞を播種した後、プレートを10回ゆっくりと前後に振り、5%のCO2インキュベーターで繰り返します。インキュベーション後、培地を0.4mLの新鮮培地に変更する。
SINEUP-GFPを分析するために、各チューブにpEGFP-C2、SINEUP-GFP、トランスフェクション試薬、オプチメムを用いて、0.1mLの混合溶液を用いた1.5mLチューブを複数作り、室温で20分間インキュベートします。各チューブからこの混合溶液の0.1mLを24ウェルプレートの別々のウェルに追加し、これらのウェルにSINEUP-GFP1、2、3、4、および5でラベルを付けます。5%のCO2インキュベーターで24時間、プレートを摂氏37度でインキュベートします。
24時間後、0.5mLのPBSで細胞を洗浄します。1体積トリプシンあたり0.05%の重量の25uLを追加し、5分間の5%のCO2インキュベーターでインキュベートします。ウェルごとに275uLのセル培地を加えます。
タンパク質抽出のために、2つのプレートのうちの1つを取り、1つのウェルから225uLまたは細胞の4分の3を収穫し、RNA抽出のために75uLまたは細胞の4分の1をそれぞれ別々の1.5mLチューブに収穫する。摂氏4度で5分間6000xgで遠心分離機。遠心分離後、タンパク質単離により標識されたチューブから上清を慎重に除去する。
細胞に60uLの溶解溶液を加え、摂氏4度で1時間ゆっくりと回転させてミックスを徹底的に混合して混ぜます。チューブを14,000xgで摂氏4度で10分間遠心分離し、タンパク質上清を収集します。タンパク質濃度を決定するために、最初に0.2〜1.5mg/mLタンパク質の範囲の濃度で、超純水中の新鮮な牛血清アルブミンタンパク質標準の5〜6倍の希釈を調製します。
働く試薬Aダッシュミックスを調製するために、2mLチューブ内の試薬Aの1mLに20uLの試薬Sを加える。負のコントロールとして水の5 uLを追加します。そして、各ウェルにBSA標準またはタンパク質サンプルを用いた。
25uLの試薬Aダッシュを加え、気泡形成を避け、1ウェルあたり200uLの試薬Bを慎重に添加する。プレートをアルミニウムホイルで覆い、室温で5~8分間インキュベートします。分光光度計で750nmのタンパク質吸光度を測定します。
BSA標準タンパク質濃度をx軸にプロットし、それぞれの吸光度をy軸にプロットして標準曲線を作成します。サンプルタンパク質濃度を計算するために標準曲線方程式を適用します。タンパク質分離を開始するには、タンパク質サンプルの各体積に2倍の負荷染料を1ボリューム追加します。
摂氏90度で5分間加熱し、すぐに氷の上で1分間冷やします。10~20ugのタンパク質サンプルを10%SDSポリアクリルアミドゲルにロードし、100~150Vで分離します。ゲルからタンパク質を、半乾燥転写器により0.5マイクロメートルのニトロセルロース膜に移す。
25Vで30分間転送バッファを充填します。転写後、膜を容器に入れ、膜が完全に浸されるまでブロッキング溶液を加え、振盪して室温で30分間インキュベートする。適切な抗体をブロッキング溶液に加え、膜上に注ぎます。
振動しながら、室温で30分間膜をインキュベートしてハイブリダイズします。ハイブリダイゼーション後、室温で5分間1倍TBSTバッファーを加えて膜を洗浄し、さらに2回繰り返します。次のハイブリダイゼーションを、膜上のブロッキング溶液で希釈した二次抗体で、揺れながら室温で30分間行う。
その後、室温で1x TBSTバッファーを5分間加えて膜を洗浄し、さらに2回繰り返します。HRP強化ECL試薬ミックスの2 mLで満たされた箱に膜を移します。箱をアルミホイルで覆い、室温で1~2分間インキュベートします。
ECL試薬ミックスから膜を慎重に取り出し、発光イメージング装置を使用して露出します。イメージングによる細胞内のSINEUP-GFPの効果を解析するには、pEGFP-C2、およびSINEUP-GFPの細胞を24ウェルプレートから、1ウェルあたり0.5mLのPBSで洗浄します。核を染色するには、各ウェルにHoechst-33342の2ugを追加し、20分間摂氏37度で細胞をインキュベートします。
高スループットのマイクロウェル画像サイトメーターを使用して、Hoechst染色細胞を測定し、細胞の総数をカウントする。GFP陽性細胞の数をカウントするために緑色蛍光の強度を測定する。分析するには、SINEUPsのタンパク質アップレギュラクタ効果を、イメージングソフトウェアを使用してGFPの統合強度を決定し、各チャネルで得られたセグメント化されたオブジェクトの信号を表示するすべてのピクセル強度の合計として計算します。
最適結合ドメインとエフェクタードメインGFPの両方を含む合成SINEUPであるSINEUPとのトランスフェクションが成功した後、mRNA翻訳はGFP mRNAの発現を変化させることなくアップレギュレートした。半自動画像解析のプロトコルは、従来のウェスタンブロット分析と比較して、検出時間を改善し、同時にスクリーニングされるサンプルの数を増加させました。シグナル強度には差があったが、ウェスタンブロット解析では2.6倍からイメージング解析では1.4倍まで、コントロールと比較して有意に高いレベルのGFP蛍光が検出された。
この手順を試みる際には、正しいバインド ドメインを設計するために、ターゲット mRNA の正しいシーケンスを識別することを忘れないでください。遺伝子はプロモーターから転写されることが多く、異なる翻訳開始部位を使用する可能性があります。ゼンブブラウザは、このようなmRNA分散を探索するのに非常に便利なツールです。
また、可変バインディングサイトを持つ異なるSINEUPを設計することをお勧めします。全体として、SINEUPsを標的の多重性に迅速に適応させることは、siRNAの分野に対する相互的かつ無料である既存のRNAの積極的に規制された翻訳で構成される新しい分野を確立すると考えています。これらの機能の一部は、この技術がバイオリアクターのようなインビトロでより多くのタンパク質を産生するのに役立つと考えています。
