黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムにおけるアルカリ性フォスファターゼ活性の比色分析

このプロトコルは、S.aureusバイオフィルム培養におけるアルカリ化ホスファターゼ活性を測定するための容易で信頼性の高い方法を提示した。バイオフィルム形成におけるALPの機能を理解するのに役立ちます。この手法の主な利点は、高スループットです。

それは非常に敏感で、実行しやすいです。この手順のデモンストレーションは、ハーパー・カレッジの元学生、ケビン・ダニコフスキです。TSBを調製するには、カゼインの膵臓消化、大豆ミールのパパニックダイジェスト、塩化ナトリウム、デキストロース、リン酸二カリウムを蒸留水に加えます。

フラスコをアルミホイルで覆い、オートクレーブに入れて使用前に滅菌します。TSAを準備するには、TSBに寒天を加え、殺菌のためにオートクレーブに入れます。その後、室温まで冷まします。

次に、1皿あたり20ミリリットルの比率でペトリ皿に注ぎます。バイオフィルム培地を調製するために、グルコースをオートクレーブTSBに加えて1リットル当たり10グラムの濃度を達成する。真空ろ過キットを使用して、0.2マイクロメートルの細孔サイズのフィルターで溶液を濾過します。

接種するには、殺菌接種ループを使用して、ペトリ皿からステープルアウレウスのコロニーを1つ選び、10ミリリットルのTSBで満たされた培養管に入れます。チューブをインキュベーターに入れて摂氏37度で一晩成長させます。マイクロピペットを使用して、100マイクロリットルの一晩培養を行い、1:100体積比希釈のためにグルコースでTSBの10ミリリットルを充填した培養管に移します。

一定の濃度のために混合する渦。マイクロピペットを使用して、希釈培養物200マイクロリットルを1つの96ウェルプレートから合計18個のウェルに移します。バイオフィルム形成のために摂氏37度で96ウェルプレートを24時間インキュベートします。

S.aureusの最高のバイオフィルム形成のために、フラットまたはラウンドボトム96ウェルプレートを選ぶ方が良いです。その後、プレートを少し傾けて、各ウェルの端から吸引して上清をデカントします。1X PBSでそれぞれをよく洗います。

遠心分離機にプレートを入れて毎分8,000回転で5分間回転させ、吸引によって上澄をデカントします。各ウェルに市販のPNPPからなるバッファ状ALP基板の75マイクロリットルを加え、タイマーを使用して三重に各時点を記録する。各インキュベーションタイムポイントの後、反応を停止するために3つのウェルのそれぞれに5モル水酸化ナトリウムの75マイクロリットルを加えます。

1分間に800回転でプレートを5分間遠心します。ピペットを使用して、100マイクロリットルの上澄み物を新しい96ウェルプレートに移して熱量測定を行います。96ウェルプレートリーダーを使用して、405ナノメートルで各ウェルの吸光度を測定します。

30分のタイムポイントウェルを使用して、バックグラウンドノイズを制御します。3つの96ウェルプレートで実験全体を繰り返します。このプロトコルは、タンパク質の単離を必要としないS.aureusバイオフィルムのALP活性を測定するための迅速かつ信頼性の高いアッセイを開発する。

ALP 活動の代表的な結果は、最大 75 分間の増加傾向を示しています。75分後、ALP活性の増加は認められなかった。良いバイオフィルム文化を確立することは非常に重要であり、習得するにはかなりの数の試験が必要な場合があります。

当社や他の人々が以前に報告したように、結晶紫色のアッセイを行うことによってバイオフィルム形成を確認したり、バイオフィルム形成を容易にするために、ヒトの血漿でプレートを事前に処理することができます。その開発後、バイオフィルム形成を妨げる可能性のある潜在的なALP阻害剤をスクリーニングすることができます。その結果、医療分野におけるバイオフィルム管理に向けた重要な情報が提供されます。

5モル水酸化ナトリウムは、接触した場合に危険である可能性があります。取扱い時には、必ず個人用保護具を着用してください。