この方法は、複数の次元で肝臓のダイナミクスの進化に沿ってマウス肝臓内の血管の動きを視覚化するのに役立ちます。この方法を用いれば、肝臓内の血管の動態を3次元で可視化できる。血管染料の使用を実証しましたが、顕微鏡的な視覚化の前に目的の物質で血管染色を行うことができます。
麻酔下8週齢の雄C 57黒6マウスで右反射の欠如を確認した後。マウスの尾を75%アルコールで拭き、30ゲージ針を装備した1マイクロリットルの注射器を使用して、ローダミンBイソチオシアネート・デキストランの100マイクロリットルに1ミリグラムのローダミンBイソチオシアネート・デキストランを付け加えた尾部静脈に10ミリグラムを注入します。すべての溶液が送達されたら、綿棒を使用して穿刺部位に圧力をかけ、無菌水で濡れたガーゼを使用して腹部の毛皮を浸します。
かみそりを使って腹部を剃り、毛皮の方向にストロークを作り、マウスを摂氏37度のアルコールで除菌した加熱パッドの上に置きます。身体臓器イメージングフレームでマウス肝臓を固定するには、まず、きれいな5ミリメートル直径の吸引カップを固定位置に配置し、75%アルコールで加熱パッドと吸引カップを拭きます。吸引カップを真空ポンプホースに接続し、ポンプをオンにします。
75%アルコール殺菌テーブルでは、手術用はさみを使用して、マウスの下胸骨の境界から2センチメートルの皮膚を切断し、肝臓を露出させます。マウスと加熱パッドをボディフレームのホルダーベースに置き、吸引カップが肝臓を保持できるように臓器イメージング器具を調整します。次に、肝臓がカップに取り付けることができるように吸引のために30〜35キロパスカルの負圧を使用します。
多光子レーザー走査顕微鏡を設定するには、顕微鏡をオンにして、60 Xの目的を選択します。目的の下にフレームとマウスを固定し、レンズをカバーするのに十分な大きさのカップに通常の生理液線のドロップを追加します。レンズが通常の生理音に触れ、レーザーソフトウェアをオンにするように目的を調整します。
レーザーをオンにし、電源ボタンとシャッターを3秒間押し続けます。その後、顕微鏡の操作ソフトウェアを起動し、800ナノメートルにレーザーを設定します。画像取得制御を設定するには、蛍光スイッチをクリックし、部屋と機器の照明をオフにします。
顕微鏡のライトパスシャッターを開き、蛍光フィルターを第4の歯車に回転させます。オプティカルスイッチの2つのレバーを引いてアイピースを見て、焦点距離を調整するためにコースと細かい焦点準スパイラルを使用します。次に、X Y 軸を使用して、ターゲット領域を見つけるために視野を調整します。
イメージングの場合は、ソフトウェアの蛍光スイッチをオフにして、蛍光フィルターを第2のギアに切り替えます。光スイッチの2つのレバーを押し、フォーカス倍を2回クリックして、ターゲット領域をプレビューして取得設定と画像取得制御パラメータを調整し、プレスコントロールとCを押して高電圧ゲインとオフセットを調整します。[停止]をクリックしてプレビューを停止し、[X Y]ボタンをクリックして2次元でスキャンし、[保存]をクリックします。
領域を選択し、深さをクリックしてプレビューし、顕微鏡設定で終了セットと開始セットを選択します。3D画像をスキャンして保存します。スキャン後、リージョンのクリック時間を選択し、他の取得設定と画像取得制御パラメータを調整します。
次に、別のスライスをスキャンし、結果のイメージムービーを取得するために保存します。ここで示されるように多光子顕微鏡を用いた肝臓内の血管の分布の可視化が、観察できる。この血管は、幹から発せられる複数の枝に分かれ、周囲の空間に分布する。
血管内腔が暗い間、血管の外周は赤で観察され、血管内を移動する赤い物体以外の物体が細胞である可能性がある。このビデオで観察された組織の暗闇は、肝臓が時間の経過とともに十分に固定されていない可能性が高い.瘢痕のない肝臓がどのように固定されているかは、画像の安定性に影響を与えることを覚えておくことが重要です。
この方法論は、肝臓内の他の構造の位置に適用して、関心のある特定の労働構造の分布または変化を直接観察することができる。
