이 방법은 여러 차원에서 간 역학의 진화를 따라 마우스 간 내의 혈관의 움직임을 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 3 차원에서 간 내혈관의 역학을 시각화할 수 있습니다. 우리는 사용 혈관 염료를 시연했지만 현미경 시각화 전에 관심있는 물질로 혈관 염색을 수행 할 수 있습니다.
마취 된 8 주 된 남성 C 57 블랙 6 마우스에서 오른쪽 반사의 부족을 확인 한 후. 마우스의 꼬리를 75%의 알코올로 닦아내고 30 게이지 바늘을 장착한 마이크로리터 주사기를 사용하여 로다민 B 이소티오네이트-엑스트라엔100마이크로리터에 새로 준비된 로다민 B 이소티오야네이트-엑스트라엔의 밀리리터당 10밀리그램을 코달린에 주입한다. 모든 용액이 전달되면 면봉을 사용하여 천개 부위에 압력을 가하고 멸균물로 젖은 거즈를 사용하여 복부 모피를 담급니다.
면도기를 사용하여 복부를 면도하여 모피 방향으로 스트로크를 만들고 마우스를 섭씨 37도, 알코올 에 감염된 가열 패드에 놓습니다. 바디 장기 화상 진찰 프레임으로 마우스 간을 고정하기 위하여는, 첫째는 고정된 위치에 깨끗한 5 mm 직경 흡입 컵을 놓고 75% 알콜로 가열 패드 및 흡입 컵을 닦아냅니다. 진공 펌프 호스에 흡입 컵을 연결하고 펌프를 켭니다.
75%의 알코올 살균 테이블에 는 수술 용 가위를 사용하여 마우스의 하부 흉골 경계에서 2 센티미터의 피부를 자르고 간을 노출시합니다. 마우스와 가열 패드를 체프레임의 홀더 베이스에 놓고 오르간 이미징 기구를 조정하여 흡입 컵이 간을 잡을 수 있도록 합니다. 그런 다음 간이 컵에 부착되도록 흡입을 위해 30 ~35 킬로파스칼의 음압을 사용합니다.
다광레이저 스캐닝 현미경을 설정하려면 현미경을 켜고 60 X 목표를 선택합니다. 목표 아래 프레임과 마우스를 고정하고 렌즈를 덮을 만큼 큰 컵에 일반 식염수를 추가합니다. 렌즈가 일반 식염수에 닿고 레이저 소프트웨어를 켜면 목표를 조정합니다.
레이저를 켜고 3초 동안 전원 버튼과 셔터를 길게 누릅니다. 그런 다음 현미경 작동 소프트웨어를 시작하고 레이저를 800 나노미터로 설정합니다. 이미지 수집 컨트롤을 설정하려면 형광 스위치를 클릭하고 방 및 장비 조명을 끕니다.
현미경의 라이트 패스 셔터를 열고 형광 필터를 네 번째 기어로 회전시다. 광학 스위치의 두 레버를 당기고 눈조각을 통해 찾고, 코스와 미세 초점 주체 나선형을 사용하여 초점 거리를 조정합니다. 그런 다음 X Y 축을 사용하여 뷰 필드를 조정하여 대상 영역을 찾습니다.
이미징의 경우 소프트웨어의 형광 스위치를 끄고 형광 필터를 두 번째 기어로 전환합니다. 광학 스위치의 두 레버를 푸시하고 초점 시간을 2번 클릭하여 대상 영역을 미리 보고 획득 설정 및 이미지 획득 제어 파라미터 및 프레스 컨트롤 및 C를 눌러 고전압 게인 및 오프셋을 조정합니다. 미리보기를 중지하려면 중지를 클릭하고 X Y 버튼을 클릭하여 두 차원에서 스캔하고 저장을 클릭합니다.
리전을 선택하고 깊이를 클릭하고 미리 보기를 클릭하여 현미경 설정에서 끝을 선택하고 집합을 시작합니다. 3D 이미지를 스캔하고 저장합니다. 스캔 후 지역 클릭 시간을 선택하고 다른 획득 설정 및 이미지 수집 제어 매개 변수를 조정합니다.
그런 다음 다른 조각을 스캔하고 저장하여 결과 이미지 동영상을 가져옵니다. 여기서 는 입증된 바와 같이 다중 광자 현미경을 사용하여 간 내혈관의 분포를 시각화하고, 관찰될 수 있다. 이 혈관은 트렁크에서 방출되는 복수의 가지로 나누어 주변 공간으로 분배된다.
혈관내외경은 내부 구멍이 어두우면서 적색으로 관찰될 수 있으며, 배 내에서 움직이는 비적물체에서 관찰된 바와 같이 세포일 수 있다. 이 비디오에서 관찰 된 조직의 어둠은 시간이 지남에 따라 잘 고정되지 않은 간 때문일 수 있습니다. 흉터가 없는 간이 어떻게 고정되는지, 이미지의 안정성에 영향을 미친다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이러한 방법론은 또한 관심있는 특정 노동 구조의 분포 또는 변화의 직접적인 관찰을 위해 간 내의 다른 구조물의 위치에 적용될 수 있다.
