Este método puede ayudarnos a visualizar los movimientos de los vasos sanguíneos dentro del hígado del ratón a lo largo de la evolución de la dinámica del hígado en múltiples dimensiones. Usando este método, podemos visualizar la dinámica de los vasos sanguíneos dentro del hígado en tres dimensiones. Hemos demostrado el uso de tinte vascular, pero puede realizar la tinción del vaso con su sustancia de interés antes de la visualización microscópica.
Después de confirmar la falta de reflejo de derecha en un macho anestesiado de ocho semanas de edad C 57 negro seis ratón. Limpie la cola del ratón con un 75% de alcohol y use una jeringa de un microlitro equipada con una aguja de calibre 30 para inyectar 10 miligramos por mililitro de ródamina B isotiocyanato-dextrano recién preparado en 100 microlitros de Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran en la vena de cola caudal. Cuando se haya entregado toda la solución, utilice un hisopo de algodón para aplicar presión al lugar de la punción y use gasa húmeda con agua estéril para remojar el pelaje abdominal.
Usa una maquinilla de afeitar para afeitar el abdomen, haciendo golpes en la dirección del pelaje, y coloca el ratón en una almohadilla de calentamiento desinfectada de 37 grados Celsius, alcohol. Para arreglar el hígado del ratón con un marco de imágenes de órganos corporales, primero coloque una ventosa limpia de cinco milímetros de diámetro en una posición fija y limpie la almohadilla de calefacción y la ventosa con un 75% de alcohol. Conecte la ventosa a la manguera de la bomba de vacío y encienda la bomba.
En una mesa esterilizada 75% alcohol use tijeras quirúrgicas para cortar dos centímetros de piel del borde inferior del esternón del ratón y exponer el hígado. Coloque el ratón y la almohadilla de calentamiento en la base del soporte del marco del cuerpo y ajuste el accesorio de imágenes de órganos para que la ventosa pueda sostener el hígado. A continuación, utilice una presión negativa de 30 a 35 kilopascales para succión para que el hígado se adhieran a la taza.
Para configurar el microscopio de escaneo láser multifotófono, encienda el microscopio y seleccione el objetivo 60 X. Fije el marco y el ratón debajo del objetivo y agregue una gota de solución salina normal a la taza lo suficientemente grande como para cubrir la lente. Ajuste el objetivo para que la lente toque la solución salina normal y encienda el software láser.
Encienda el láser y mantenga pulsado el botón de encendido y el obturador durante tres segundos. A continuación, inicie el software operativo del microscopio y ajuste el láser a 800 nanómetros. Para configurar el control de adquisición de imágenes, haga clic en el interruptor fluorescente y apague las luces de la habitación y del equipo.
Abra el obturador de la trayectoria de luz en el microscopio y gire el filtro de fluorescencia a la cuarta marcha. Tire de las dos palancas del interruptor óptico y mirando a través de la pieza del ojo, utilice el curso y las cuasi espirales de enfoque fino para ajustar la distancia focal. A continuación, utilice los ejes X Y para ajustar el campo de visión para localizar el área de destino.
Para obtener imágenes, apague el interruptor fluorescente del software y cambie el filtro fluorescente a la segunda marcha. Empuje las dos palancas del interruptor óptico y haga clic en los tiempos de enfoque dos para obtener una vista previa del área objetivo ajustar la configuración de adquisición y los parámetros de control de adquisición de imagen y presionar el control más C para ajustar la ganancia y el desplazamiento de alto voltaje. Haga clic en Detener para detener la vista previa, haga clic en el botón X Y para escanear en dos dimensiones y haga clic en Guardar.
Seleccione una región y haga clic en profundidad y vista previa para seleccionar los conjuntos de finalización e inicio en la configuración del microscopio. Escanea imágenes 3D y guarda. Después de escanear, seleccione una región haga clic en el tiempo y ajuste la otra configuración de adquisición y los parámetros controlados por adquisición de imágenes.
A continuación, escanee los diferentes sectores y guárdelo para obtener la película de imagen resultante. Aquí se puede observar la visualización de la distribución de vasos sanguíneos dentro del hígado utilizando microscopía de múltiples fotones como se ha demostrado. Este vaso sanguíneo se divide en una pluralidad de ramas que emanan de un tronco y se distribuyen en el espacio circundante.
La circunferencia externa del vaso sanguíneo se puede observar en rojo, mientras que la cavidad interna es oscura, como se observa en el video los objetos no rojos que se mueven dentro de los vasos podrían ser células. La oscuridad del tejido observado en este video es probable debido a que el hígado no se ha fijado bien con el tiempo. Es importante recordar que cómo se fija el hígado sin cicatrices, afecta la estabilidad de la imagen.
Esta metodología también se puede aplicar a la posición de otras estructuras dentro del hígado para la observación directa de la distribución o cambios en estructuras laborales específicas de interés.
