Cette méthode peut nous aider à visualiser les mouvements des vaisseaux sanguins dans le foie de souris le long de l’évolution de la dynamique du foie en plusieurs dimensions. En utilisant cette méthode, nous pouvons visualiser la dynamique des vaisseaux sanguins dans le foie en trois dimensions. Nous avons démontré l’utilisation de colorant vasculaire, mais vous pouvez effectuer la coloration du navire avec votre substance d’intérêt avant la visualisation microscopique.
Après avoir confirmé un manque de réflexe de droitage chez un mâle anesthésié de huit semaines C 57 souris noire de six. Essuyez la queue de la souris avec 75% d’alcool et utilisez une seringue d’un microlitre équipée d’une aiguille de calibre 30 pour injecter 10 milligrammes par millilitre de Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran fraîchement préparé dans 100 microlitres de Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran dans la veine caudale de la queue. Lorsque toute la solution a été livrée, utilisez un coton-tige pour appliquer une pression sur le site de perforation et utilisez de la gaze humide avec de l’eau stérile pour tremper la fourrure abdominale.
Utilisez un rasoir pour raser l’abdomen, faire des coups dans le sens de la fourrure, et placer la souris sur un 37 degrés Celsius, l’alcool désinfecté coussin chauffant. Pour fixer le foie de souris avec un cadre d’imagerie d’organe de corps, placez d’abord une ventouse propre de cinq millimètres de diamètre dans une position fixe et essuyez le coussin chauffant et la ventouse avec 75% d’alcool. Connectez la ventouse au tuyau de la pompe à vide et allumez la pompe.
Sur une table stérilisée à 75%alcool, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper deux centimètres de peau de la bordure sternale inférieure de la souris et exposer le foie. Placez la souris et le coussin chauffant sur la base du support du cadre du corps et ajustez le montage d’imagerie d’organe de sorte que la ventouse puisse tenir le foie. Ensuite, utilisez une pression négative de 30 à 35 kilopascals pour l’aspiration de sorte que le foie se fixe à la tasse.
Pour configurer le microscope à balayage laser Multiphoton, allumez le microscope et sélectionnez l’objectif 60 X. Fixez le cadre et la souris sous l’objectif et ajoutez une goutte de solution saline normale à la tasse assez grande pour couvrir l’objectif. Ajustez l’objectif de sorte que l’objectif touche juste la solution saline normale et allumer le logiciel laser.
Allumez le laser et appuyez et maintenez le bouton d’alimentation et l’obturateur pendant trois secondes. Ensuite, démarrez le logiciel d’exploitation au microscope et réglez le laser à 800 nanomètres. Pour régler le contrôle d’acquisition d’image, cliquez sur l’interrupteur fluorescent et éteignez les lumières de la pièce et de l’équipement.
Ouvrez l’obturateur de voie lumineuse sur le microscope et faites pivoter le filtre de fluorescence à la quatrième vitesse. Tirez sur les deux leviers de l’interrupteur optique et en regardant à travers le morceau d’oeil, utilisez le cours et fine mise au point quasi spirales pour ajuster la longueur focale. Utilisez ensuite les axes X Y pour ajuster le champ de vision pour localiser la zone cible.
Pour l’imagerie, éteignez l’interrupteur fluorescent du logiciel et passez le filtre fluorescent au deuxième engrenage. Poussez les deux leviers du commutateur optique et cliquez sur les temps de mise au point deux pour prévisualiser la zone cible ajuster les paramètres d’acquisition et les paramètres de contrôle d’acquisition d’image et le contrôle de la presse plus C pour ajuster le gain de haute tension et compenser. Cliquez sur arrêter pour arrêter l’aperçu, cliquez sur le bouton X Y pour numériser en deux dimensions et cliquez sur enregistrer.
Sélectionnez une région et cliquez sur la profondeur et l’aperçu pour sélectionner les ensembles de fin et de démarrage dans les paramètres du microscope. Numérisez des images 3D et enregistrez. Après numérisation, sélectionnez l’heure de clic d’une région et ajustez les autres paramètres d’acquisition et les paramètres contrôlés par l’acquisition d’images.
Puis numérisez à travers les différentes tranches et économisez pour obtenir le film d’image résultant. Ici, la visualisation de la distribution des vaisseaux sanguins dans le foie à l’aide de microscopie multi photons comme démontré, peut être observée. Ce vaisseau sanguin est divisé en une pluralité de branches émanant d’un tronc et distribués dans l’espace environnant.
La circonférence externe du vaisseau sanguin peut être observée en rouge tandis que la cavité intérieure est sombre, comme on l’observe dans la vidéo des objets non rouges se déplaçant à l’intérieur des vaisseaux pourraient être des cellules. L’obscurité du tissu observée dans cette vidéo est probablement due au fait que le foie n’a pas été réparé bien au fil du temps. Il est important de se rappeler que la façon dont le foie sans cicatrice est fixé, affecte la stabilité de l’image.
Cette méthodologie peut également être appliquée à la position d’autres structures dans le foie pour l’observation directe de la distribution ou des changements dans des structures de travail spécifiques d’intérêt.
