Bu yöntem, karaciğerin dinamiklerinin evrimi boyunca fare karaciğeri içindeki kan damarlarının hareketlerini birden fazla boyutta görselleştirmemize yardımcı olabilir. Bu yöntemi kullanarak karaciğer içindeki kan damarlarının dinamiklerini üç boyutlu olarak görselleştirebiliriz. Damar boyası kullanımını gösterdik, ancak mikroskobik görselleştirmeden önce ilgi çekici maddenizle damar boyama işlemi yapabilirsiniz.
Uyuşturulmış sekiz haftalık erkek C 57 siyah altı farede sağ refleks eksikliğini doğruladıktan sonra. Farenin kuyruğunu% 75 alkolle silin ve 30 kalibrelik bir iğne ile donatılmış bir mikrolitre şırınga kullanarak celaaudal kuyruk damarına 100 mikrolitre Rhodamine B Izotiyosiyanat-Dextran'da taze hazırlanmış Rhodamine B Izotiyosiyanat-Dextran mililitre başına 10 miligram enjekte edin. Tüm çözelti teslim edildiğinde, delinme bölgesine basınç uygulamak için pamuklu çubuk kullanın ve karın kürkünü ıslatmak için steril suyla ıslatılmış gazlı bez kullanın.
Karnı tıraş etmek için bir jilet kullanın, kürk yönünde vuruşlar yapın ve fareyi 37 santigrat derecelik, alkolle dezenfekte edilmiş bir ısıtma yastığına yerleştirin. Fare karaciğerini bir vücut organı görüntüleme çerçevesiyle sabitlemek için, öncelikle sabit bir konuma beş milimetre çapında temiz bir emiş kabı yerleştirin ve ısıtma yastığını ve emme kabını% 75 alkolle silin. Emme kabını vakum pompası hortumuna bağlayın ve pompayı açın.
% 75 alkol sterilize edilmiş bir masada, farenin alt sternal sınırından iki santimetre deri kesmek ve karaciğeri açığa çıkarmak için cerrahi makas kullanın. Fareyi ve ısıtma yastığını vücut çerçevesinin tutucu tabanına yerleştirin ve organ görüntüleme fikstürünü emme kabının karaciğeri tutabilmesi için ayarlayın. Daha sonra emme için 30 ila 35 kilopaskal negatif basınç kullanın, böylece karaciğer bardağa bağlanır.
Multiphoton Lazer Tarama Mikroskobu'nun ayarını yapmak için Mikroskobu açın ve 60 X hedefini seçin. Çerçeveyi ve fareyi hedefin altına sabitleyin ve lensi kapatacak kadar büyük bardağa bir damla normal salin ekleyin. Objektifi, lens normal saline dokunup lazer yazılımını çalıştıracak şekilde ayarlayın.
Lazeri açın ve güç düğmesini ve deklanşörü üç saniye basılı tutun. Ardından mikroskop işletim yazılımını başlatın ve lazeri 800 nanometreye ayarlayın. Görüntü alma denetimini ayarlamak için floresan anahtarı tıklatın ve oda ve ekipman ışıklarını kapatın.
Mikroskopta ışık yolu deklanşörini açın ve floresan filtresini dördüncü vitese döndürün. Optik anahtarın iki kolunu çekin ve göz parçasından bakın, odak uzaklığı ayarlamak için parkuru ve ince odaklama yarı spirallerini kullanın. Ardından, hedef alanı bulmak üzere görüş alanını ayarlamak için X Y eksenlerini kullanın.
Görüntüleme için, yazılımdaki floresan anahtarını kapatın ve floresan filtreyi ikinci vitese geçirin. Optik anahtarın iki kolunu itin ve hedef alanı önizlemek için odaklama sürelerini iki kez tıklayın, alma ayarlarını ve görüntü alma kontrol parametrelerini ayarlayın ve yüksek voltaj kazancını ve ofsetini ayarlamak için kontrol artı C tuşuna basın. Önizlemeyi durdurmak için Durdur'a tıklayın, iki boyutta taramak için X Y düğmesine tıklayın ve kaydet'e tıklayın.
Mikroskop ayarlarında bitiş ve başlangıç kümelerini seçmek için bir bölge seçin ve derinlik ve önizlemeyi tıklatın. 3D görüntüleri tarayın ve kaydedin. Taradıktan sonra, bir bölge tıklama süresi seçin ve diğer edinme ayarlarını ve görüntü alma kontrollü parametreleri ayarlayın.
Ardından farklı dilimleri tarayın ve elde edilen görüntü filmini elde etmek için kaydedin. Burada gösterildiği gibi multi foton mikroskopisi kullanılarak karaciğer içindeki kan damarlarının dağılımının görselleştirilmesi gözlenebilir. Bu kan damarı, bir gövdeden yayılan dalların çoğulluğuna ayrılır ve çevredeki alana dağıtılır.
Kan damarının dış çevresi, iç boşluk karanlıkken kırmızı renkte gözlenebilir, videoda gözlemlendiği gibi damarlar içinde hareket eden kırmızı olmayan nesneler hücreler olabilir. Bu videoda gözlemlenen dokunun koyu olması muhtemelen karaciğerin zamanla iyi sabitlenmemesi nedeniyledir. Skarsız karaciğerin nasıl sabit olduğunu, görüntünün stabilitesini etkilediğini hatırlamak önemlidir.
Bu metodoloji, dağılımın doğrudan gözlemlenmesi veya belirli işgücü yapılarındaki değişiklikler için karaciğer içindeki diğer yapıların konumuna da uygulanabilir.
