Este método pode nos ajudar a visualizar os movimentos dos vasos sanguíneos dentro do fígado do rato ao longo da evolução da dinâmica do fígado em múltiplas dimensões. Usando este método, podemos visualizar a dinâmica dos vasos sanguíneos dentro do fígado em três dimensões. Demonstramos o uso de corante vascular, mas você pode realizar a coloração do vaso com sua substância de interesse antes da visualização microscópica.
Depois de confirmar a falta de reflexo de direito em um anesthetizado macho C 57 preto seis rato. Limpe a cauda do rato com 75% de álcool e use uma seringa de um microliter equipada com uma agulha de calibre 30 para injetar 10 miligramas por mililitro de Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran em 100 microlitres de Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran na veia caudal da cauda. Quando toda a solução tiver sido entregue use um cotonete para aplicar pressão no local da punção e use gaze molhada com água estéril para absorver a pele abdominal.
Use uma navalha para raspar o abdômen, fazendo traços na direção da pele, e coloque o rato em uma almofada de aquecimento desinfetada de 37 graus Celsius. Para fixar o fígado do rato com uma estrutura de imagem de órgão corporal, primeiro coloque um copo de sucção de cinco milímetros limpo em uma posição fixa e limpe a almofada de aquecimento e a ventosa com 75% de álcool. Conecte a ventosa à mangueira da bomba de vácuo e ligue a bomba.
Em uma mesa esterilizada de 75% de álcool use uma tesoura cirúrgica para cortar dois centímetros de pele da borda severa inferior do camundongo e expor o fígado. Coloque o mouse e a almofada de aquecimento sobre a base do suporte da estrutura corporal e ajuste a fixação de imagem do órgão para que o copo de sucção possa segurar o fígado. Em seguida, use uma pressão negativa de 30 a 35 quilopascals para sucção para que o fígado se apegue ao copo.
Para configurar o microscópio de varredura a laser multifotônio, ligue o Microscópio e selecione o objetivo de 60 X. Fixar o quadro e o mouse sob o objetivo e adicionar uma gota de soro fisiológico normal ao copo grande o suficiente para cobrir a lente. Ajuste o objetivo para que a lente toque o soro fisiológico normal e ligue o software laser.
Ligue o laser e pressione e segure o botão de alimentação e o obturador por três segundos. Em seguida, inicie o software operacional do microscópio e defina o laser para 800 nanômetros. Para definir o controle de aquisição de imagens clique no interruptor fluorescente e desligue as luzes da sala e do equipamento.
Abra o obturador do caminho de luz no microscópio e gire o filtro de fluorescência para a quarta marcha. Puxe as duas alavancas do interruptor óptico e olhando através da peça do olho, use o curso e focando finamente quase espirais para ajustar a distância focal. Em seguida, use os eixos X Y para ajustar o campo de visão para localizar a área alvo.
Para a imagem, desligue o interruptor fluorescente no software e mude o filtro fluorescente para a segunda marcha. Empurre as duas alavancas do interruptor óptico e clique em foco vezes duas para visualizar a área de destino ajustar as configurações de aquisição e os parâmetros de controle de aquisição de imagem e o controle de pressão mais C para ajustar o ganho e deslocamento de alta tensão. Clique em parar para interromper a visualização, clique no botão X Y para digitalizar em duas dimensões e clique em salvar.
Selecione uma região e clique em profundidade e visualização para selecionar os conjuntos finais e iniciar nas configurações do microscópio. Digitalize imagens 3D e salve. Após a digitalização, selecione uma região clique em tempo e ajuste as outras configurações de aquisição e parâmetros controlados de aquisição de imagens.
Em seguida, digitalize as diferentes fatias e salve para obter o filme de imagem resultante. Aqui pode ser observada a visualização da distribuição dos vasos sanguíneos dentro do fígado usando microscopia multifótons, conforme demonstrado. Este vaso sanguíneo é dividido em uma pluralidade de ramos emanando de um tronco e distribuídos para o espaço circundante.
A circunferência externa do vaso sanguíneo pode ser observada em vermelho enquanto a cavidade interna é escura, como observado no vídeo objetos não vermelhos movendo-se dentro dos vasos podem ser células. A escuridão do tecido observado neste vídeo é provavelmente devido ao fígado não ter sido bem fixado ao longo do tempo. É importante lembrar que como o fígado sem cicatrizes é fixado, afeta a estabilidade da imagem.
Essa metodologia também pode ser aplicada à posição de outras estruturas dentro do fígado para a observação direta da distribuição ou mudanças em estruturas específicas de trabalho de interesse.
