Questo metodo può aiutarci a visualizzare i movimenti dei vasi sanguigni all'interno del fegato di topo lungo l'evoluzione della dinamica del fegato in più dimensioni. Usando questo metodo, possiamo visualizzare la dinamica dei vasi sanguigni all'interno del fegato in tre dimensioni. Abbiamo dimostrato l'uso del colorante vascolare, ma è possibile eseguire la colorazione del vaso con la sostanza di interesse prima della visualizzazione microscopica.
Dopo aver confermato la mancanza di riflesso di destro in un maschio di otto settimane anestetizzato C 57 nero sei topo. Pulire la coda del topo con il 75% di alcol e utilizzare una siringa a microliter dotata di un ago calibro 30 per iniettare 10 milligrammi per millilitro di Rhodamine B Isotiocianato-Dextran appena preparato in 100 microlitri di Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran nella vena della coda caudale. Una volta che tutta la soluzione è stata consegnata, utilizzare un batuffolo di cotone per applicare pressione sul sito di puntura e utilizzare una garza bagnata con acqua sterile per immergere la pelliccia addominale.
Usa un rasoio per radere l'addome, facendo ictus nella direzione della pelliccia, e posiziona il mouse su un tampone riscaldante disinfettato con alcool di 37 gradi Celsius. Per fissare il fegato del mouse con un telaio per l'imaging di organi del corpo, posizionare innanzitutto una ventosa pulita di cinque millimetri di diametro in posizione fissa e pulire la pastiglia riscaldante e la ventosa con il 75% di alcol. Collegare la ventosa al tubo della pompa per vuoto e accendere la pompa.
Su un tavolo sterilizzato al 75% di alcol utilizzare forbici chirurgiche per tagliare due centimetri di pelle dal bordo sternale inferiore del topo ed esporre il fegato. Posizionare il mouse e il tappetino riscaldante sulla base portante del telaio del corpo e regolare l'apparecchio di imaging dell'organo in modo che la ventosa possa contenere il fegato. Quindi utilizzare una pressione negativa da 30 a 35 kilopascal per l'aspirazione in modo che il fegato si attacchi alla tazza.
Per impostare il microscopio a scansione laser Multiphoton, accendere il microscopio e selezionare l'obiettivo 60 X. Fissare il telaio e il mouse sotto l'obiettivo e aggiungere una goccia di soluzione salina normale alla tazza abbastanza grande da coprire l'obiettivo. Regola l'obiettivo in modo che l'obiettivo tocchi solo la normale salina e accendi il software laser.
Accendere il laser e tenere premuto il pulsante di accensione e l'otturatore per tre secondi. Quindi avviare il software operativo al microscopio e impostare il laser su 800 nanometri. Per impostare il controllo di acquisizione dell'immagine, fare clic sull'interruttore fluorescente e spegnere le luci della stanza e dell'apparecchiatura.
Aprire l'otturatore del percorso della luce sul microscopio e ruotare il filtro a fluorescenza alla quarta marcia. Tirare le due leve dell'interruttore ottico e guardando attraverso l'oculare, utilizzare il percorso e le quasi spirali di messa a fuoco fine per regolare la lunghezza focale. Quindi usate gli assi X Y per regolare il campo visivo per individuare l'area di destinazione.
Per l'imaging, spegnere l'interruttore fluorescente nel software e passare il filtro fluorescente alla seconda marcia. Spingere le due leve dell'interruttore ottico e fare clic sulla messa a fuoco per due per visualizzare in anteprima l'area di destinazione regolare le impostazioni di acquisizione e i parametri di controllo dell'acquisizione dell'immagine e il controllo della pressione più C per regolare il guadagno e l'offset dell'alta tensione. Fare clic su Interrompi per interrompere l'anteprima, fare clic sul pulsante X Y per eseguire la scansione in due dimensioni e fare clic su Salva.
Selezionate un'area e fate clic su profondità e anteprima per selezionare i set di fine e inizio nelle impostazioni del microscopio. Scansiona le immagini 3D e salva. Dopo la scansione, selezionare il tempo di clic di un'area e regolare le altre impostazioni di acquisizione e i parametri controllati per l'acquisizione dell'immagine.
Quindi scansiona le diverse sezioni e salva per ottenere il filmato dell'immagine risultante. Qui si può osservare la visualizzazione della distribuzione dei vasi sanguigni all'interno del fegato utilizzando la microscopia multifotona come dimostrato. Questo vaso sanguigno è diviso in una pluralità di rami che emanano da un tronco e distribuiti nello spazio circostante.
La circonferenza esterna del vaso sanguigno può essere osservata in rosso mentre la cavità interna è scura, come osservato nel video gli oggetti non rossi che si muovono all'interno dei vasi potrebbero essere cellule. L'oscurità del tessuto osservata in questo video è probabilmente dovuta al fatto che il fegato non è stato riparato bene nel tempo. È importante ricordare che come viene fissato il fegato senza cicatrici, influisce sulla stabilità dell'immagine.
Questa metodologia può anche essere applicata alla posizione di altre strutture all'interno del fegato per l'osservazione diretta della distribuzione o cambiamenti in specifiche strutture di lavoro di interesse.
