재조합 폭스테일 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염 클론주사에 의해 옥수수 묘목의 직접 농경화

요약

농균 계 주사 (농업 주입) 프로토콜은 옥수수 묘목으로 여우 꼬리 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 클론의 접종을 위해 제시된다. 이러한 방식으로 접종은 바이러스 감염, 마커 유전자의 바이러스 유발 유전자 침묵, GFP의 바이러스 과발현으로 이어집니다.

초록

Agrobacterium 기반 접종 접근 법은 식물 조직에 바이러스 벡터를 도입하는 데 널리 사용됩니다. 이 연구는 바이러스 벡터를 운반하는 Agrobacterium 와 결합 조직 근처 옥수수 묘목의 주입을위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 유전자 염기질 및 유전자 발현을 위해 설계된 재조합 폭스테일 모자이크 바이러스(FoMV) 클론이 이 방법을 최적화하는 데 사용되었고, 유전자 발현을 위해 설계된 재조합 사탕수수 모자이크 바이러스(SCMV)를 포함하도록 그 사용이 확장되었다. 유전자 단편 또는 코딩 서열은 이진 T-DNA 플라스미드 벡터 pCAMBIA1380으로 복제된 수정된 전염성 바이러스 게놈으로 삽입된다. 결과 플라스미드 구조는 Agrobacterium tumefaciens 변형 GV3101로 변환됩니다. 옥수수 모종4 일 정도 된 _MgSO4 솔루션에서 재중단 된 박테리아와 콜옵티어 노드 근처에 주입 될 수 있습니다. Agrobacterium감염 시 바이러스 게놈을 운반하는 T-DNA는 옥수수 세포로 옮겨져 바이러스 RNA 게놈의 전사를 허용합니다. 재조합 바이러스가 식물 전체에 걸쳐 복제되고 체계적으로 확산됨에 따라, 표적 유전자의 침묵으로부터 인한 바이러스 증상 및 페노티픽 변화는 잎에서 관찰될 수 있다(les22) 또는 식물성 desaturase (pds)는 자외선을 가진 문턱 또는 유광액의 발현을 관찰할 수 있다. 바이러스를 검출하고 삽입물의 무결성을 동시에 평가하기 위해, RNA는 주입된 식물의 잎으로부터 추출되고 RT-PCR은 삽입된 서열을 운반하는 다중 복제 부위(MCS)를 측면에 있는 프라이머를 사용하여 수행된다. 이 프로토콜은 여러 옥수수 유전자형에서 효과적으로 사용되었으며 다른 바이러스 벡터로 쉽게 확장하여 옥수수에서 바이러스 벡터 도입을위한 접근 가능한 도구를 제공합니다.

서문

많은 식물 바이러스의 전염성 클론은 바이러스 유발 유전자 침묵(VIGS), 유전자 과발현(VOX), 그리고 가장 최근에는 바이러스 지원 유전자 편집(VEdGE)^{1,2,2,3,4,5,6,7,9,10,11}에 대해 설계되었습니다^. . 새로운 바이러스 구조가 개발됨에 따라 이러한 수정된 바이러스로 식물 조직을 성공적으로 감염하는 방법도 고려해야 합니다. 식물에서 바이러스 감염을 시작하는 현재 방법은 입자 폭격을 포함, 체외 RNA 전사체 또는 DNA 클론의 문지름 접종, 혈관 천자 접종, 또는 Agrobacterium tumefaciens 접종 접종 (농림막)5,12,13,14,15,16,17 . 이러한 각 접종 방법은 주어진 식물 바이러스 시스템 내에서 비용, 특수 장비의 필요성 및 타당성을 포함하는 고유의 장점과 단점을 가지고 있습니다. 재조합 바이러스를 전달하기 위해 설계된 이진 T-DNA 구조를 포함하는 Agrobacterium 균주의 침투 또는 주입을 활용하는 방법은 간단하고 저렴하기 때문에 바람직하다. 그러나, 제아 메이스(maize)와 같은 단응종에 대한 상세한 농경화 방법은 부족하다.

바이러스 전달을 위한 농약의 첫번째 보고의 한은 1986년에 간행되었습니다, 콜리플라워 모자이크 바이러스의 게놈 (CaMV)가 T DNA 구조물로 삽입되고, 이 구조물을 운반하는 결과 Agrobacterium은 순무 식물에 문지르기 접종되었다¹⁸. 농업 접종을 위한 추가 방법은 그 이후로 개발되었습니다. 예를 들어, 폭스테일 모자이크 바이러스(FoMV)의 경우, 니코티아나 벤타미아나는 무분부^{한 소스를 제공하는} 잎에서 바이러스 입자를 생성하는 중간 숙주로서 사용될 수 있다6. 감염된 N. benthamiana 잎을 사용하여 옥수수의 문지비 접종은 효율적이고 빠르며 간단하지만 중간 숙주의 사용은 모든 옥수수 감염 바이러스에 작동하지 않습니다. 예를 들어 슈가케인 모자이크 바이러스(SCMV)는 N. 벤타미아나를 감염시킬 수 없으며, 이 바이러스로부터 유래된 벡터에 대한 대체 접종원의 사용을 요구한다. 1988년, 옥수수 줄무늬 바이러스(MSV)를 함유한 아그로박테리움은 주사(agro주입)에 의해 옥수수 묘목으로 도입되었으며, 아그로박테리움 기반 접종 방법을 시연하는 것은 모노코브¹⁹에도 유용하다. 농업 주입이 초기 성공에도 불구하고, 옥수수에서이 기술을 활용 하는 몇 가지 연구 출판 되었습니다., RNA 바이러스와 VIGS에 대 한이 방법의 적용에 대 한 열린 질문을 떠나, VOX, 그리고 VEdGE 벡터^20,21,22. 그러나, 모노코트 종에서 농사주입의 광범위한 사용은 유망한, 이 일반적인 접근은 오키드, 쌀 및 밀23,24,25,26,27,28에서 이용되었기 때문에.

이 프로토콜은 FoMV 및 Agrobacterium 균주 GV3101에 최적화되었으며 SCMV 벡터에도 적용되었습니다. FoMV는 56 모노코트와 디코 종을 포함하는 넓은 숙주 범위를 가진 ^potexvirus29입니다. FoMV는 6.2킬로베이스(kb) 양성 감각, 5개의 개방 판독 프레임(ORFs)에서 5개의 다른 단백질을 인코딩하는 단하나 좌초 RNA 게놈^을 30,31,32,33,34,35^로 갖는다. FoMV는 이전에 T-DNA 플라스미드 백본^6,36,37에 전염성 클론을 통합하여 옥수수를 위한 VIGS 및 VOX 벡터로 개발되었다. 바이러스 게놈은 비그네시 적용을 위해 비그(VIGS) 적용을 위해 수정되었다(MCS1*) 즉시 하류의 코트 단백질(CP)(도 1A)³⁶. VOX 및 VEdGE 애플리케이션의 경우 CP 프로모터가 복제되고 두 번째 복제 사이트(MCS2)가 추가되어 ORF 4와 CP(그림 1B)⁶ 사이의 관심 서열 삽입을 가능하게 했습니다. 인서트가 없는 MCS1과 MCS2를 모두 포함하는 FoMV 벡터는 FoMV 빈 벡터(FoMV-EV)(그림 1)입니다.

SCMV는 옥수수 ³⁸에서 VOX를 위해 개발 된 관련이없는 바이러스입니다. 포티비리대 가문의 일원이며, 그 중 몇몇 회원들은 planta39,40,41,42,43,44에서 외국 단백질을 표현하도록 설계되었다. SCMV의 호스트 범위는 옥수수, 사탕수수 및 사탕수수^45,46을 포함하며, 이러한 주요 작물 식물^36,38에서 유전자 기능 연구에 귀중합니다. SCMV는 길이^47,48에서 약 10kb의 양성 감각, 단일 좌초 RNA 게놈을 갖는다. SCMV VOX 벡터를 만들기 위해 잘 확립된 P1/HCPro 접합은 이종 체계³⁸의 삽입 부위로 활용되었다. 이러한 복제 부위는 NIa-Pro 프로테아제 분열 부위를 인코딩하여 SCMV 다단백(도 1C)으로부터 독립적인 단백질의 생산으로 이어진다.

이러한 재조합 바이러스의 전염성 cDNA를 운반하는 T-DNA 플라스미드는 Agrobacterium 균주 GV3101로 변형되었습니다. GV3101은 노팔린 형 균주로, T-DNA를 옥수수^26,28,49종을 포함한 단응종으로 옮길 수 있는 것으로 잘 알려져 있다. 또한, 이전 농사 연구는 균주 C58 또는 그것의 유도체 GV3101, 뿐만 아니라 ^19,20,22,27를 사용 ^했습니다.

3개의 마커 유전자는 이 프로토콜의 발달에서 이용되었습니다: 유전자 침묵을 위한 2개 및 유전자 발현을 위한 1개. 옥수수 유전자 병변 모방 22(les22, GRMZM2G044074)로부터 329염기쌍(bp) 단편을 사용하여 침묵 벡터 FoMV-LES22를 구성하는 데 사용하였다. les22가 옥수수에서 침묵할 때, 괴사 세포의 작고 둥근 패치는 괴사 잎 조직50의 넓은 지역으로 확장하고 결합하는 잎의 혈관을 따라 나타납니다⁵⁰. FoMV-PDS, sorghum 유전자 phytoene desaturase에서 313 bp 단편을 포함 (PD, LOC10436156, 96% 시퀀스 ID 는 옥수수 PD, GRMZM2G410515), 옥수수에서 PD의 침묵을 유도, 암투에 따라 사진 표백 세포의 작은 줄무늬의 결과 ^1. 녹색 형광 단백질(GFP)을 위한 온전한 코딩 서열은 FoMV(FoMV-GFP) 및 SCMV(SCMV-GFP)에 대한 단백질 발현을 입증하는 데 사용되었습니다. 잎의 GFP 발현은 일반적으로 14일 사후 접종(DPI)⁶에서 가장 검출할 수 있다. 옥수수에 있는 바이러스 벡터의 농업 주입을 이용한 이전 연구 결과가 있더라도, 이 실험은 단지 농사주입이 옥수수 묘목에서 감염성 클론에서 바이러스성 감염을 용이하게 할 수 있고 VIGS 또는 VOX 응용을 위해 디자인된 재조합 바이러스로 확장하지 않는 것을 보여주었습니다^19,20,21,22. 여기에 제시된 프로토콜은 이전 농사 방법, 특히 Grismley 등 ^al.19를 기반으로 합니다. 전반적으로, 이 농사 법은 VIGS 및 VOX 벡터와 호환되며, 특수 장비 또는 대체 호스트를 접종 소스로 필요로 하지 않으며, 생체 내재 또는 체외 전사가 필요한 다른 일반적인 방법에 비해 접종을 설정하고 수행하는 데 필요한 전체 시간과 비용을 감소시킵니다. 이 프로토콜은 VIGS, VOX 및 VEdGE와 관련된 응용 프로그램과 함께 옥수수에서 기능 적 유전체학 연구를 용이하게 할 것입니다.

프로토콜

1. 플라스미드 건설

참고: 이 프로토콜은 다른 바이러스 벡터 또는 Agrobacterium 균주에 적용될 수 있습니다, 그러나 이것은 농업 주입에 의하여 접종의 전반적인 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. 항상 라미나르 플로우 후드에서 세균 접종 및 도금 단계를 수행합니다.

1. FoMV 침묵 구조
   참고: 루리아-베르타니(LB) 미디어(밀러)는 달리 명시되지 않는 한 모든 미디어에 사용됩니다. 액체 LB는 1,000mL의 증류수로 25 g의 과립을 일시 중단하고 121 °C에서 15 분 동안 오토클레이브하여 만들어집니다. 솔리드 LB 미디어는 오토클레이브 전에 1.5%의 화고를 첨가하여 유사하게 만들어집니다. 항생제는 LB가 ~ 60 °C로 냉각 된 후 첨가되고 용액을 95 x 15 mm 페트리 플레이트로 부어 넣습니다. 사용하는 항생제 농도는 다음과 같습니다 : 리팜피신 (rif) 에서 25 μg / mL, 50 μg / mL에서 젠타마이신 (젠트), 50 μg / mL에서 카나마이신 (칸) 50 μg /mL.
   1. PCR은 PacI 제한 부위와 XbaI 제한 부위를 가진 역 프라이머를 사용하여 침묵(예를 들어, les22 또는 pds)이 침묵할 옥수수 유전자로부터의 단편을 증폭시한다. 이를 통해 안티센스 방향으로 FoMV-pCAMBIA1380 바이너리 벡터의 MCS1*에 유전자 단편을 결집할 수 있습니다.
      참고: DNA 폴리머라아제 사양에 따라 각각 10μM, 플라스미드 DNA 템플릿 및 물에 고충실도 DNA 폴리머라제, 전방 및 역프라이머를 사용하여 PCR을 설정합니다. DNA 폴리머라제 및 프라이머 용융 온도(Tm)에 따른 어닐링 온도를 이용하여 35사이클을 증폭하고, 킬로베이스당 30초 연장을 증폭한다.
   2. 키트 사양에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 정화를 수행합니다.
   3. 정제된 PCR 제품 및 FoMV-EV를 제한 효소 XbaI 및 PacI로 소화합니다. 효소 사양에 따라 인큐베이션.
   4. 제조업체의 프로토콜에 따라 T4 DNA 리개제와 함께 소화된 PCR 제품 및 FoMV-EV를 리게이트합니다.
   5. 공래 플라스미드를 열 쇼크 방법을 사용하여 화학적으로 유능한 대장균 세포로 변형시킨다.
      1. 얼음에 세포를 해동하고 튜브에 플라스미드 의 3 μL을 추가합니다. 얼음에 30분 동안 배양한 다음 42°C에서 30초 동안 충격을 가열합니다.
      2. 얼음 위에 5분 간 놓고, 이화탄(SOC)을 가진 200 μL 슈퍼 최적 국물을 추가하고 , 대장균 세포가 225 rpm에서 흔들리는 37°C에서 1시간 동안 SOC 미디어에서 회복할 수 있도록 합니다.
      3. 카나마이신 선택적 LB 매체에 플레이트와 하룻밤 사이에 37°C에서 배양한다.
   6. 프라이머 FM-5840F 및 FM-6138R(보충 표 1)을 사용하여 Sanger 시퀀싱에 의해 정확한 클론을 확인하십시오. Sanger 시퀀싱을 수행하는 시설에 플라스미드 DNA 250 ng를 제출하십시오. 이 실험 샘플을 위해 아이오와 주립 대학 DNA 코어 시설로 보내졌습니다.
   7. 선택한 식민지와 액체 LB의 2 mL을 접종하고 225 rpm에서 흔들림과 함께 하룻밤 37 °C에서 배양. 알칼리성 리시스 플라스미드 DNA 제제를 통해 하룻밤 문화에서 플라스미드 DNA를 추출하여 ⁵².
   8. 플라스미드 DNA를 동결 해동 방법을 사용하여 아그로박테리움 균주 GV3101 세포로 변환합니다. 화학적으로 유능한 세포 100 μL을 얼음 위에 해동시키고, 플라스미드 1-5 μL을 추가하고 얼음에 30분 동안 배양할 수 있습니다. 액체 질소에 1 분 동안 놓고 37 °C에서 3 분 동안 배양하십시오. SOC의 1mL를 추가하고, 28°C에서 2-3h의 흔들림, 리프, 젠트 및 칸 선택적 LB 미디어에 플레이트를 회수하고 2일 동안 28°C에서 배양할 수 있도록 한다.
   9. 콜로니 PCR인 삽입의 존재를 위한 스크린 콜로니. 하나의 세균 식민지를 선택하고 물 30 μL에 혼합. 폴리머라제 마스터 믹스 12.5 μL, 각 10μM 프라이머의 1.25 μL, FM-5840F 및 FM-6138R의 3 μL, 세균 식민지 서스펜션의 3 μL, 그리고 64°C의 안날링 온도로 35회 의 최종 부피(14°C)를 추가하여 PCR 반응을 설정합니다.
   10. 올바른 아그로박테리움 콜로니와 액체 LB (리프, 젠트, 칸)의 2-5 mL접종. 225 rpm에서 흔들리면서 28 °C에서 하룻밤 동안 자랄 수 있습니다.
   11. 하룻밤 문화를 50% 글리세롤 용액1:1과 섞으세요. 장기 보관을 위해 -80°C에 보관하십시오.
2. FoMV 식 구조
   1. PCR은 1.1.1에 설명된 바와 같이 시작 및 정지 코돈(예를 들어, GFP)을 포함한 관심의 코딩 시퀀스를 증폭시키고, 전방 프라이머에 Bsu36I 제한 부위를 추가하고, 반대 입문서상 PspOMI 제한 부위를 역프라이머에 추가하여 MCS2로의 방향 방향 방향방향으로 방향 클론링을 가능하게 한다.
   2. 키트의 사양에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 정화를 수행합니다.
   3. 1.1.3에 기재된 바와 같이 제한 효소 Bsu36I 및 PspOMI로 PCR 제품 및 FoMV-EV를 소화한다.
   4. 제조업체의 프로토콜에 따라 T4 DNA 리개제와 함께 소화된 PCR 제품 및 FoMV-EV를 리게이트합니다.
   5. 1.1.5에 기재된 바와 같이 열 쇼크 방법을 사용하여 DH5α화학적으로 유능한 대장균 세포로 변환한다. 카나마이신 선택적 LB 매체에 플레이트와 하룻밤 사이에 37°C에서 배양한다.
   6. 프라이머 5AmuS2 및 5AmuA2 (보충 표 1)를 사용하여 1.1.6에 설명된 바와 같이 Sanger 시퀀싱에 의해 정확한 클론을 확인하십시오.
   7. 선택한 식민지와 액체 LB의 2 mL을 접종하고 225 RPM에서 흔들림과 함께 하룻밤 37 °C에서 배양. 알칼리성 리시스 플라스미드 DNA 제제를 통해 하룻밤 문화에서 플라스미드 DNA를 추출하여 ⁵².
   8. 1.1.8에 설명된 바와 같이 동결 해동 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 아그로박테리움 균주 GV3101 화학적으로 유능한 세포로 변환한다. 리프, 젠트 및 칸 선택적 LB 미디어에 플레이트 및 2 일 동안 28 °C에서 배양.
   9. 프라이머 5AmuS2 및 5AmuA2를 사용하여 콜로니 PCR로 인서트가 있는 스크린 콜로니.
   10. 정확한 아그로바테리움 콜로니와 함께 2-5mL 액체 LB(리프, 젠트, 칸)를 접종한다. 28 °C에서 225 rpm에서 하룻밤 을 흔들어.
   11. 하룻밤 문화를 50% 글리세롤 용액1:1과 섞으세요. 장기 보관을 위해 -80°C에 보관하십시오.
3. SCMV 식 구문
   1. PCR은 1.1.1에 설명된 바와 같이 스톱 코돈(예를 들어, GFP)의 관심 유전자를 증폭시키고, 전방 프라이머상 PspOMI 소화 부위및 역프라이머상 SbfI 소화 부위를 포함하여 SCMV-pCAMBIA1380 바이너리 벡터로 방향 클론을 가능하게 한다.
      참고: 삽입은 바이러스 성 다단백으로 프레임에 복제되어야 합니다.
   2. 키트의 사양에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 정화를 수행합니다.
   3. 1.1.3에 기재된 바와 같이 제한 효소 PspOMI 및 SbfI로 PCR 제품 및 SCMV-EV를 소화한다.
   4. 제조업체의 프로토콜에 따라 T4 DNA 리개세와 함께 소화된 PCR 제품 및 SCMV-EV를 리게이트합니다.
   5. 1.1.5에 기술된 바와 같이 열 쇼크 방법을 사용하여 DH5α화학적으로 유능한 대장균 세포로 제품을 변환한다. 칸 선택적 LB 매체에 플레이트와 하룻밤 37 °C에서 배양.
   6. 프라이머 SC-745F 및 HCProR1(보충 표 1)을 사용하여 1.1.6에 기술된 바와 같이 Sanger 시퀀싱에 의한 정확한 클론에 대한 스크린 콜로니.
   7. 선택한 식민지와 액체 LB의 2 mL을 접종하고 225 rpm에서 흔들림과 함께 하룻밤 37 °C에서 배양. 알칼리성 리시스 플라스미드 DNA 제제를 통해 하룻밤 문화에서 플라스미드 DNA를 추출한다⁵².
   8. 플라스미드 DNA를 1.1.8에 설명된 바와 같이 동결 해동 방법을 사용하여 화학적으로 유능한 세포인 아 그로박테리움 균주 GV3101로 변환한다. 리프, 젠트 및 칸 선택적 LB 미디어에 플레이트 및 2 일 동안 28 °C에서 배양.
   9. 1.1.9에 기재된 바와 같이 프라이머 SC-745F 및 HCProR1을 가진 콜로니 PCR을 가진 인서트가 존재하기 위한 스크린 콜로니.
   10. 올바른 아그로박테리움 콜로니와 액체 LB (리프, 젠트, 칸)의 2-5 mL접종. 28 °C에서 225 rpm에서 하룻밤 을 흔들어.
   11. 하룻밤 문화를 50% 글리세롤 용액1:1과 섞으세요. 장기 보관을 위해 -80°C에 보관하십시오.

2. 묘목 준비

1. 식물 1-2 옥수수 씨앗 ('골든 밴탐' 달콤한 옥수수, FR1064, B73 등) 사탄 기반 성장 매체에 작은 인서트 안에 배치 트레이 에 배치 4-7 일 주입 하기 전에 일. 22°C에서 16시간 이하의 성장챔버에 22°C(~185광합성활성방사선(PAR)) 또는 16시간 미만의 온실에 22-25°C, 22-25°C(350-400 PAR)에서 8박을 배치한다.
   참고: Agrobacterium 에 대한 감수성은 옥수수 유전자형마다 다르며 성공률에 영향을 미칩니다. 또한, 일부 바이러스 벡터는 특정 옥수수 유전자형과 호환되지 않을 수 있습니다.
2. 15-5-15 액체 비료로 일주일에 한 번 정기적으로 물을 비옥하게 하며 백만 분의 330 부품(PPM)으로 비료를 분주시합니다.

3. 아그로바테리움 준비

1. 주사 하루 전에, 적절한 항생제 (리프, 젠트, 칸)로 LB 액체 매체를 준비하고 원하는 바이러스 구조를 운반하는 Agrobacterium 균주와 접종한다. 20 μL의 글리세롤 육수를 LB 50mL에 추가하는 것이 좋습니다 >.
   참고: 4-5개 식물마다 600nm(_OD600)의 광학 밀도에서 최소 1mL의 세균 현탁액을 가질 수 있는 충분한 접종을 준비한다.
2. 24 시간 동안 28 °C에서 225 rpm에서 흔들어주세요.
3. 실온에서 4,000 x g 에서 10 분 동안 펠릿 박테리아. 상부체를 폐기합니다.
4. 피펫팅 또는 부드러운 소용돌이로 1mL의 탈이온(DI) 물로 펠릿을 철저히 씻으십시오.
5. 반복 단계 3.3 펠릿 박테리아에.
6. 10m _MgSO4 용액의 1mL에서 피펫팅 또는 부드러운 소용돌이로 펠릿을 다시 중단합니다.
   1. 선택적으로, 용액에 200 μM 아세토시링본을 추가합니다. 비록 일반적으로 사용, 아 세 이링곤 일부 Agrobacterium 균주의 변환 능력을 향상. 저자는 아세토시링돈의 추가가이 프로토콜의 효율성에 영향을 미친다는 것을 발견하지 못했습니다 (보충 표 2).
      참고: 10m _MgSO4 용액은 실온에 저장된 6.3의 pH가 있는 1M 스톡 용액으로 만들 수 있다. 솔루션은 pH 조정이 필요하지 않을 수 있습니다.
7. 분광계로 샘플의 _OD600을 측정하고 10m _MgSO4 용액으로 1.0 _OD600으로 희석합니다.
   참고: 이것은 안전한 정지 지점입니다. 세균 현탁액은 주입 전에 최대 5 시간 동안 실온에서 보관 할 수 있습니다.

4. 주입

참고: 4-7일 된 옥수수 묘목은 주사에 사용할 수 있습니다. 모종 성장률은 성장 조건, PAR의 양(즉, 성장 챔버보다 온실에서 더 높은 PAR) 및 유전자형에 의해 크게 영향을 받습니다. 식물은 잎이 팽창하지 않고 7 일 까지 더 낮은 둥근 팁 잎이 확장 될 때 키가 2~3cm인 경우 4 일 의 어린 주입 될 수 있습니다. 이 접종 방법의 성공률은 파종 후 7 일 이상 식물 나이가 빠르게 떨어집니다. 주사 부위는 모종의 나이에 상관없이 동일합니다.

1. 안전 고글을 착용하고, 1 mL 일회용 주사기에 부착 된 25G x 5/8 "바늘을 사용하여 콜옵티어 노드 위의 2-3mm 묘목에 세균 현탁액을 주입하십시오.
   참고: 콜옵티어 노드는 크라운 뿌리가 결국 형성되는 곳입니다. 이 노드는 플랜트에서 가장 낮은 노드입니다. 일반적으로 노드 안팎에서 녹색에서 흰색으로 색상이 변경됩니다. 주사 위치는 메리스템 바로 위에 있습니다. 이 단계에서 몇 묘목을 해부하면 메리 스템의 위치를 시각화하고 결과적으로 적절한 주입 부위를 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
2. 현탁액이 콜로피틸을 채우거나 식물의 성장 단계에 따라 whorl에서 볼 때까지 주사기에 부드러운 압력을 가하십시오. 이것은 약 100-200 μL의 서스펜션입니다.
   참고: 모종에 현탁액을 주입하기 어려운 경우 주사 부위가 너무 낮을 수 있습니다. 적당한 압력은 서스펜션을 주입하는 데 필요한 모든 것입니다.
3. 각 구문에 대한 주사기와 바늘을 변경, 모든 묘목을 주입.

5. 지속적인 식물 관리

1. 주입된 모종을 7-8일 동안 13 x 13 x 15cm 이상 냄비로 이식합니다.
2. 성장 조건 유지 (16 h 광기간 및 일주일에 한 번 수정).

6. 감염 확인 (페노전형 및 RT-PCR)

1. 페노는 일반적으로 14-21 DPI 사이의 식물 점수를 매다. 레아시온은 22또는 식물성 desaturase를 모방하는 대조군 유전자를 침묵시키는 것으로 나뭇잎에서 쉽게 볼 수 있으며 FoMV 증상과 구별된다. GFP 발현은 형광 현미경 이미징 또는 기타 UV 광 이미징을 통해 검출될 수 있다.
   참고: 일부 구조/바이러스 벡터 증상을 표시 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다 또는 전혀 증상을 표시 하지 않을 수 있습니다. 높은 빛 조건은 크게 침묵 병변 모방22 및 식물 성 수두에 의해 발생 표현형을 증가. 식물이 성장 챔버와 같은 낮은 빛 조건에서 유지되는 경우 병변이 덜 눈에 띄거나 결석 할 수 있지만 RT-PCR에 의해 결정된 실제 감염률은 영향을받지 않아야합니다 (표 1).
2. 분자적으로 감염을 확인하기 위해, 샘플 잎 6 사이 14-21 DPI 및 제조 업체의 지시에 따라 페놀 클로로폼 추출을 사용하여 총 RNA를 추출.
3. 추출된 RNA를 템플릿으로 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA를 생성합니다.
   1. 총 RNA 의 최대 5 μg, 무작위 hexamer 프라이머의 1 μL, 올리고 (dT)₁₈ 프라이머의 1 μL, dNTP의 1 μL, 1 μL 의 최종 부피1 μL및 14.5 μL의 최종 부피를 위한 물로 cDNA 반응을 설정합니다.
4. 바이러스 구조 및 cDNA를 템플릿으로 설계된 프라이머를 사용하여 각 샘플에서 PCR을 수행하여 바이러스 감염을 확인하고 1.1.1에 설명된 바와 같이 관심 있는 유전자 또는 유전자 단편의 무결성을 결정하며, FoMV의 경우 25및 SCMV에 대한 30의 주기를 감소시키는 것을 제외하고는 거짓 긍정을 피한다.
   1. FoMV 침묵 구조의 경우 프라이머 FM-5840F 및 FM-6138R을 사용하여 옥수수 유전자 단편을 포함하는 MCS1*을 통해 증폭합니다. FoMV 발현 구조의 경우, 프라이머 5AmuS2 및 5AmuA2를 사용하여 삽입된 유전자를 포함하는 MCS2를 통해 증폭한다.
   2. SCMV 발현 구조의 경우, 프라이머 SC745-F 및 HCProR1을 사용하여 삽입된 유전자(보충 도 3)를 포함하는 MCS 를 통해 증폭합니다.
   3. 내인성 대조군 유전자의 경우, 옥수수 액틴 (GRMZM2G126010) 또는 프라이머 ZmUbiF 및 ZmUbiR의 mRNA 단편을 증폭시키는 프라이머 ZmActS 및 ZmActA를 사용하여 옥수수 폴리우비퀴틴 (GRMZM2G409726_T01)의 mRNA 단편을 증폭시한다.
5. 바이러스 및 유전자 또는 유전자 단편의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 핵산 얼룩을 함유하는 1% 아가로즈 젤에 PCR 제품을 시각화한다.

결과

이 연구의 목표는 옥수수 모종으로 유전자 침묵 또는 유전자 발현을 위해 설계된 재조합 바이러스를 직접 도입하기위한 간단한 프로토콜을 개발하는 것이었습니다 (그림 2). 인서트를 운반하는 바이러스 벡터는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 설계 및 복제됩니다. 침묵을 위한 유전자 단편은 FoMV-EV에서 MCS1*에 삽입되고, 발현을 위한 코딩 서열은 MCS2또는 MCS에서 SCMV-EV에서 FoMV-EV에 삽입됩니다. 결과 플라스미드는 아그로박테리움 균주 GV3101로 옮겨져 있습니다. 그 후, 옥수수 묘목은 심기 후에 1 주일 이내에 주입됩니다. 주입 후 2 주, 식물 바이러스 감염에 대 한 pheno전형 및 분자, 유전자 침묵, 그리고 유전자 발현에 대 한 분자 평가 될 수 있다.

옥수수 식물은 4-7 일 동안 토탄 기반 매체에서 재배됩니다. 이 단계에서, 촬영 apical 메리스템은 콜옵티어 노드 (그림 3A)바로 위에 있습니다. 콜로틸이 파종 후 7일까지 2-3센티미터 또는 최대 연장한 후, 식물은 콜옵틸라 노드(그림 3B-F)에서 2-3mm 를 주입한다. 주입 후 약 12 일, 식물은 그들의 잎에 침묵 현상형을 표시하기 시작할 것입니다, 일반적으로 혈관 조직 근처에서 관찰되고, 이 병변은 FoMV 바이러스 성 모자이크 현상과 시각적으로 구별됩니다 (그림 4). FoMV의 존재와 표적 유전자의 침묵은 주입된 식물에서 검출할 수 있습니다(도 5). GFP 발현은 형광 현미경으로 주입 후 2주 까지 검출될 수 있으며 잎 5-7에서 가장 강하다(도 6). 형광 이미징 시스템에서 관찰될 때, FoMV로부터의 GFP 발현은 혈관 조직 근처의 나뭇잎에 분포된 형광의 많은 작은 천자 영역과 더 큰 패치로 구성될 수 있다(도 6, 보충도 1). 바이러스 성 모자이크 증상은 종종 FoMV 침묵 구조에 감염된 식물에 볼 수 있지만, 성공적으로 GFP를 표현하는 GFP 발현 구조로 주입 된 식물은 종종 이러한 증상이 없습니다. 결과적으로 눈에 띄는 증상이없는 식물은 여전히 바이러스 및 GFP 발현에 긍정적 일 수 있습니다. 추가적으로, 농경술 절차 도중 메리스템을 천공하는 것은 형태학적 결함을 일으키는 원인이 될 수 있기 때문에 피해야 합니다, 그러나 결과식물은 살아 있고 수시로 현상입니다 (그림 7).

이 프로토콜은 원래 달콤한 옥수수를 사용하여 개발되었지만, 여러 옥수수 근친선은 농경을 사용하여 FoMV 유전자 침묵 구조로 성공적으로 접종 될 수 있습니다. 예를 들어, FR1064 및 B73은 전형적으로 바이러스 감염의 높은 비율을 가지고 있습니다(표 2). 특히, Mo17은 FoMV에 대한 알려진 유전적 저항을 가진 선으로, 예상대로 0%의 감염 효율을 보였습니다^36,53. 또한 사용되는 구조는 감염 효율(표 3)에 영향을 미칩니다. FoMV의 경우, FoMV-EV 및 FoMV-LES22는 전형적으로 각각 53%와 54%로 가장 높은 감염 효율을 갖는다. FoMV-PDS의 효율은 38%로 약간 낮으며 FoMV-GFP는 17%로 가장 낮습니다. SCMV-GFP의 감염 효율은 8%입니다. 이러한 백분율은 여러 실험에 비해 평균입니다. 개별적인 실험은 더 높거나 더 낮은 감염 효율성을 가질 수 있습니다.

그림 1: 옥수수에서 농사에 사용되는 FoMV 및 SCMV T-DNA 클론의 회로도 표현. FoMV 벡터에는 두 개의 여러 복제 사이트(MCS1* 및 MCS2)가 포함되어 있습니다. 빈 벡터인 FoMV-EV는 7,269bp이며 MCS에 인서트가 포함되어 있지 않습니다. (A) FoMV 벡터를 이용한 유전자 침묵은 전형적으로 반감각 방향으로 관심서열(SOI)으로 지정된 MCS1*에 유전자 단편을 삽입함으로써 달성될 수 있다. (b) FoMV 벡터를 이용한 유전자 발현은 SOI로 지정된 감각 방향으로 MCS2에 유전자 ORFs를 삽입함으로써 달성될 수 있다. (C) SCMV 벡터는 P1과 HCPro 사이에 하나의 MCS를 갖도록 설계되었습니다. 빈 벡터인 SCMV-EV는 11,015bp이며 MCS에 인서트가 포함되어 있지 않습니다. SCMV 폴리프로틴으로 프레임에 있는 MCS에 삽입된 유전자 ORFs는 단백질로 표현될 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 농사 성 프로토콜의 회로도 요약. (A) 클론 SOI, CDS 또는 유전자 단편, 바이러스 벡터로 및 Agrobacterium 균주 GV3101로 변환. (B) 옥수수를 심고 4-7 일 동안 자랍니다. (C) 28°C에서 하룻밤 사이에 액체 배양에서 GV3101을 성장시키는 것(D) 주사를 위한 세균현탁액을 준비한다. (E) 100-200 μL의 서스펜션으로 콜옵티알라 노드 위에 2-3mm 의 묘목을 주입한다. (F) 이식 묘목은 7일 생후 더 큰 냄비에, 5^일 잎이 보일 때까지 2~3주 동안 자랍니다. 원하는 경우 표현형. (G) 샘플 잎 5 및 추출 RNA. (H) cDNA를 만들고 바이러스/SOI를 증폭하기 위해 PCR을 수행합니다. (I) 질적 분석을 위해 젤에서 실행하여 바이러스의 존재/부재와 잘린 또는 손상되지 않은 SOI를 결정합니다. 이 그림은 BioRender.com 함께 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 콜로토틸 노드 바로 위에 모종을 접종하는 농약 방법. (A) 4-5일 된 식물. 콜로피틸이 완전히 확장되고 첫 번째 참잎이 부분적으로 보일 수 있지만 풀이 풀리지 않습니다. (B) 6-7일 된 식물. 첫 번째 잎은 확장 될 수 있지만 칼라가 표시되지 않습니다. 두 번째 잎도 볼 수 있으며이 단계에서 풀기 시작할 수 있습니다. (C) 콜로틸 노드와 관련하여 촬영 정물 메리스템의 위치를 보여주는 6-7일 된 식물의 해부. (D) 4-5일 된 식물의 주입. (E) 6-7일 된 식물의 주입. (F) 염료 용액을 사용하여 6-7일 된 식물을 주입하여 모종의 후에서 나오는 염색된 접종을 나타낸다. (G) 콜로틸 노드와 관련하여 6-7일 된 식물의 주입 부위를 클로즈업한다. (H) 6-7 일 된 식물의 클로즈업 후 주입, 식물의 whorl에 염색 된 접종을 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: 농사 실험에 사용되는 침묵 조절 유전자의 증상. (A) 식물이 FoMV-LES22로 주입된 후 17 DPI에서 촬영한 잎. FoMV-LES22는 항감각 방향으로 22개의 옥수수 유전자를 모방한 병변 의 3'CDS의 329bp 삽입을 전달한다. 침묵은 독성 대사 산물의 축적을 초래하여 차례로 혈관을 따라 줄무늬로 나타나고 여기에 표시된 대로 더 큰 패치로 성장하는 괴사 병변을 일으킵니다. (B) 식물이 FoMV-PDS를 주입한 후 17 DPI에서 촬영한 잎. FoMV-PDS는 안티센스 방향으로 수쿰 식물토엔 데사투라제 유전자의 3'CDS의 313개의 베이스 페어 삽입을 전달한다. 옥수수에서 PD 의 침묵은 여기에 표시된 바와 같이 잎의 길이를 따라 더 긴 줄무늬로 성장하는 혈관을 따라 작고 얇은 줄무늬로 시작하는 전신 광표백 표현형을 일으킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: FoMV 유전자 침묵 구조로 주입된 식물의 qRT-PCR. FoMV-LES22 및 FoMV-PDS에 의해 유도된 전신 FoMV 감염 및 유전자 침묵의 확인은 달콤한 옥수수 식물에서 농사를 통해 전달됩니다 (골든 x Bantam). (A) 젤 이미지는 5개의 개별 식물의 잎 6에서 FoMV-MCS1* 빈 벡터(315bp amplicon) 및 FoMV-PDS(625bp amplicon)의 존재를 확인하는 RT-PCR 분석을 나타낸다. 사용 된 PCR 프라이머는 MCS1 *에 걸쳐 앰플리시온을 생성합니다. 옥수수 유전자 actin (Zm-Actin) 앰플리시온은 참조 유전자역할을한다. 막대 그래프는 FoMV-MCS1* 또는 FoMV-PDS를 통한 농약에 의한 37일 후 접종(DPI)에서 리프 6에서 pd식에 대한 qRT-PCR 상대식 값을 나타냅니다. PD 의 억제는 5개의 생물학적 복제물(p=0.003; 포스트 Hoc Dunnett의 시험; 오류 막대)에서 검출할 수 있습니다. (B) 젤 이미지는 5개의 개별 식물의 잎 6에서 FoMV-MCS1*(315 bp amplicon)의 존재를 확인하는 RT-PCR 분석을 보여줍니다. FoMV-LES22(625bp amplicon)는 10개의 개별 식물을 위한 잎 6 조직(샘플 FoMV-LES22 1-5, 38 DPI) 및 잎 4(샘플 FoMV-LES22 6-10, 20 DPI)에서 검출되었다. Zm-Actin 앰플리슨은 기준 유전자로 봉사했다. 막대 그래프는 FoMV-MCS1* 또는 FoMV-LES22 바이러스 구조의 농약에 의한 옥수수 조직에서 레22 식에 대한 qRT-PCR 상대식 값을 나타냅니다. Les22 억제는 10개의 생물학적 복제물 중 9개에서 발생합니다(p=<0.0001; 포스트 hoc Dunnett의 테스트; 오류 막대는 세 가지 기술적 복제에 대한 SD를 나타냅니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. 농사 실험에 사용되는 다양한 구조의 표현형. 모든 이미지 식물은 6-7일 전에 Agrobacterium 균주 GV3101이 표시된 구조물을 운반할 때 주입되었다. 이미지는 16 DPI에서 촬영되었습니다. (A) pCAMBIA1380(빈 플라스미드 백본), FoMV-EV, FoMV-GFP 및 SCMV-GFP의 잎 증상은 가시광선으로, 플루어캠 엽록소 필터 아래 250μs 노출, 10ms 노출에서 플루어캠 GFP 필터 하에서. (B) 모의 처리 (_MgSO4 용액으로 주입), FoMV-EV 및 FoMV-GFP 주입 식물의 잎의 형광 현미경 이미지. DIC, DsRed 및 EGFP 채널이 각각 1500ms 노출로 표시됩니다. 스케일 바는 200 μm 입니다.

그림 7. 주입의 형태학적 효과. 결합 조직으로 직접 주입에서 발생할 수있는 더 심각한 형태학적 효과의 예. 이 부상은 잎의 "파쇄"와 줄기의 분할을 초래할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

바이러스	성장 조건	유전자 형	# 감염된 식물	식물의 총 #	% 감염	감염의 평균 %
포엠V-EV	성장 챔버	달콤한 옥수수	22	23	96%	97%
		B73	18	18	100%
		B104	20	21	95%
	온실	달콤한 옥수수	20	23	87%	89%
		B73	17	18	94%
		B104	16	19	84%
SCMV-EV	성장 챔버	달콤한 옥수수	14	21	67%	47%
		B73	5	18	28%
		B104	10	21	48%
	온실	달콤한 옥수수	14	23	61%	49%
		B73	0	19	0%
		B104	19	22	86%

표 1: 온실 및 성장 챔버 조건의 효과 농경 접종 효율에. 씨앗은 동일한 성장 조건하에서 발아되었습니다. 발아 묘목은 농약되었고 그 중 절반은 성장 챔버로 옮겨졌으며 (25 °C 16 h 일광 / 22C 8 박; 185 PAR) 및 나머지 절반은 온실로 이동하였다 (22-25 °C 16 시간 일광 / 22-25 °C 8 박; 350-400 PAR). 이 표는 RT-PCR에 의해 확인된 식물의 수로부터 계산된 감염 비율을 각 바이러스에 감염하여 각 바이러스에 감염되는 식물의 총 수로 나누어 산출한 백분율로 보고합니다. 성장 챔버와 온실 조건 사이의 감염 효율성에 통계적 차이가 없습니다 (FoMV 두 꼬리 t-테스트 p =0.08; SCMV 두 꼬리 t-테스트 p=0.96).

옥수수 유전자형	포엠V-EV			포엠V-레22			합계 합계
	감염	합계	% 감염	감염	합계	% 감염	% 감염
달콤한 옥수수	18	23	78%	15	23	65%	72%
MO47	7	22	32%	1	21	5%	19%
K55	1	15	7%	3	17	18%	13%
W64A	10	22	45%	8	20	40%	43%
MO17	0	16	0%	0	13	0%	0%
B73	10	18	56%	7	17	41%	49%
B101	12	21	57%	8	24	33%	44%
FR1064	4	4	100%	4	4	100%	100%
B104	10	22	45%	5	21	24%	35%
WCC22	2	7	29%	4	6	67%	46%
A188	0	3	0%	4	6	67%	44%

표 2: 옥수수 유전자형에 걸쳐 FoMV 구조의 감염 효율. FoMV-EV 및 FoMV-LES22는 옥수수의 11가지 유전자형으로 농약되었다. 주입 후, 모종은 온실로 이동했다. 이 표는 RT-PCR에 의해 확인된 바와 같이 FoMV에 감염된 식물의 수에서 계산된 백분율로 감염의 비율을 상세히 설명합니다. 감염의 결합된 총 비율은 시험된 두 FoMV 구조물을 위한 각 유전자형의 감염의 평균 비율을 보여줍니다.

플랜트 스테이지	4-5일 오래된 식물			6-7일 오래된 식물			합계 합계
	증상이 있는	총 식물	% 감염	증상이 있는	총 식물	% 감염	% 감염
포엠V-EV	42	72	58%	80	170	47%	53% (A)
포엠V-PDS	65	157	41%	66	184	36%	39% (B C)
포엠V-레22	115	195	59%	144	292	49%	54% (A B)
포MV-GFP	16	103	16%	37	217	17%	16% (C)
SCMV-GFP	10	95	11%	5	82	6%	8% (C)

표 3: 주사 실험 요약. 이 표는 골든 밴탐 달콤한 옥수수 모종에 2017년 8월부터 2018년 8월까지 수행된 주사 실험의 요약을 나타냅니다. 식물은 바이러스 증상(FoMV-EV), 침묵 증상(pds 및 les22) 또는 GFP 형광(GFP)을 시각적(FoMV-EV, FoMV-PDS 및 FoMV-LES22) 또는 플루어캠(FoMV-GFP 및 SCMV-GFP) 스크리닝을 위해 평가되었다. 결과는 4-5일 된 식물과 6-7일 된 식물뿐만 아니라 모든 식물 연령대에 걸쳐 요약을 개별적으로 보여줍니다. 4-5일 된 식물과 6-7일 된 식물(편도 ANOVA, F=0.6513)사이에는 큰 차이가 없습니다. 바이러스 구조 (Onaway ANOVA, F = <0.0001) 사이에는 투키 크라머 HSD 연결 문자 보고서를 나타내는 문자가 있습니다.

보충 표 1: 이 프로토콜에 사용되는 모든 프라이머 이름과 시퀀스를 나열하는 표입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: 아세토시링본 테스트. (A) 초기 아세토시링본 테스트, 모의 증상의 비율을 비교, FoMV-EV, 및 FoMV-LES22 접종 현탁액 사이에 주입 된 식물 과 접종 현탁액 (+) 또는 아세토시링본없이 (-). (B) 200 μM 아세토시링본(+)을 가진 아세토시링본(-)이 없는 접종 현탁액(-)과 200μM 아세토시링본(+)과 200uM 의 감염률을 최종 200uM+로 비교한다. 전반적으로, 아세피링본 치료 (Oneway ANOVA, f = 0.5452)사이에는 유의한 차이가 없었습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1: 유광 화상 진찰 및 농경화 SCMV의 분자 검증 및 옥수수에 있는 이종 단백질의 발현. 옥수수는 GFP와 나노 루시파라제(NLuc)의 CDS를 모두 포함하는 수정된 SCMV 구조로 농생주사되었다. (A) 플루어캠 이미징은 GFP의 스크리닝 및 검출을 위해 사용되었다. 왼쪽은 모의 주입 식물이며 오른쪽은 SCMV-NLucGFP 주입 식물입니다. (B) 잎 단백질 추출물은 SDS-PAGE에 의해 분리되고, NLuc, GFP 및 SCMV 코트 단백질(CP)의 존재에 대해 지시된 바와 같이 겔 내 루시파라제 분석체 또는 면역블롯에 의해 평가되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

Agrobacterium은 식물 관련 연구에서 수많은 분자 생물학 기술을 용이하게하는 필수 도구입니다. 이 연구는 VIGS 및 VOX 응용 프로그램에 대한 옥수수 조직에 직접 FoMV 및 SCMV 바이러스 벡터를 접종하기위한 농업 주입 프로토콜을 제공합니다. 주요 목표는 모노코트 작물 식물 연구를 위한 바이러스 기반 기술의 용이성과 유용성을 높이는 것입니다. 옥수수의 직접 농약은 몇 가지 바이러스에 대 한 보고 되었습니다 하는 동안, 저자는 상세한 프로토콜을 인식 하지 않습니다., 그리고 그 연구에서 VIGS와 VOX 응용 프로그램의 아무 예 ^19,22.

이 프로토콜을 개발하는 동안 주사 위치가 성공적으로 agro주사¹⁹를 통해 전신 바이러스 감염을 시작하는 핵심 요소임을 확인했습니다. 옥수수 묘목에서 메리스템의 정확한 위치는 눈으로 거의 감지 할 수 없기 때문에 지속적으로 식물에 권장 위치를 주입하는 것은 가장 큰 변수로 가정된다. 대인 관계 변화를 최소화하기 위해 몇 가지 옥수수 묘목을 메리스템으로 해부하면 위치를 더 잘 시각화하는 것이 좋습니다(그림 3C). 콜옵티알러 노드와 관련하여 메리스템의 위치는 4-7일 된 식물의 경우 거의 동일해야 합니다. 또한, 염색된 액체로 주사를 연습하면 "접종"이 잎 을 채우는 방법과 주사 부위가 염료로 표시되기 때문에 주사 부위의 정확도를 확증할 수 있습니다(그림 3G, H). 수성 조직은 농약에 가장 취약하지만, 이 조직에 직접 Agrobacterium 현탁액을 주입하면 바람직하지 않은 형태학적 효과가 있습니다 (그림 6)¹⁹. 손상된 메리줄기를 가진 식물은 살아 남기, 그러나 결과 결함은 바람직하지 않다, 따라서, 이 조직의 직접 주입을 피해야한다.

3개의 복잡한 생물학 시스템 (식물, 바이러스 및 Agrobacterium 긴장)가 조정에서 상호 작용해야 하기 때문에 농업 주입을 통해 전신 바이러스 감염의 성공적인 발사에 영향을 미칠 수 있는 몇몇 변수가 있습니다. 이 복잡한 상호 작용은 메교 영역의 급속하게 분할 세포에 의해 도움이 될 수 있습니다, 그것은 농업에 대한 이상적인 위치만들기¹⁹. Agrobacterium 균주는 바이러스 게놈을 운반하는 T-DNA를 전달하기 위하여 식물 조직의 세포를 감염시킬 수 있어야 하고, 식물은 바이러스성 복제 및 전신 감염을 시작하기 위하여 바이러스에 영향을 받기 쉬운 이어야 합니다. 옥수수 유전자형은 바이러스에 대한 감수성이 다르지만(예를 들어, Mo17은 FoMV에 내성이 있음) 또는 아그로박테리움 균주, 그러나 시험된 대다수는 FoMV와 SCMV(표 1 및 표 2)⁵³ 모두에 취약해 보입니다. 예를 들어, 근친선 FR1064 및 달콤한 옥수수 품종 골든 밴탐은 GV3101 아그로바테리움 및 FoMV 계 벡터 모두에 특히 취약할 수 있다.

샘플링된 리프 번호와 RT-PCR샘플링 시기는 바이러스 감염의 정확한 평가를 위해 매우 중요합니다. 여기에 표시된 예에서, 잎 수는 첫 번째 둥근 잎 (일반적으로 "엄지 잎"이라고 함)에서 시작하여 위쪽으로 계산하여 결정되었다. 잎이 확장되고 다음 잎이 나타나기 시작하면 채취한 채 채 샘플링되었습니다. 그러나, 샘플링에 최적인 잎은 사용된 바이러스 종, 성장 조건 및 옥수수 유전자형에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜을 새 바이러스 시스템에 적용하여 잎 및 타이밍에 대한 샘플링 전략을 최적화할 때 초기 시간 과정 실험을 권장합니다.

사용된 특정 구문은 이 프로토콜의 효율성에 큰 영향을 미칩니다. 예를 들어, 빈 벡터, FoMV-EV 및 SCMV-EV, 및 FoMV-PDS 및 FoMV-LES22는 모두 작은 인서츠(각각 313bp 및 329bp)를 함유하고 있으며, 일반적으로 이러한 실험에서 바이러스 증상이 있는 식물의 가장 높은 비율을 생성한다(표 1 및 표 2). 그러나, FoMV-GFP 및 SCMV-GFP에서 GFP ORF(720bp)의 더 큰 삽입을 운반하는 재조합 바이러스는 빈 벡터 또는 유전자 침묵 구조로 주입된 식물에 비해 훨씬 낮은 감염률을 가졌다. 이 경향은 바이러스 게놈에 있는 외인성 유전 물질의 양을 증가시켜 기인하는 바이러스성 적적합성에 부정적인 충격 때문일 지도 모릅니다. 몇몇 연구 결과는 식물 바이러스 벡터의 삽입 안정성이 주로 삽입 크기 및 순서36,54,55,56,57에 달려 있다는 것을 보여주었^습니다. 또한, FoMV 또는 SCMV 빈 벡터로 접종후 감염되는 식물의 비율에 주목할 만한 차이가 있었는데, 이는 SCMV(표 1)에 대한 이 프로토콜을 최적화하기 위해 추가 작업이 필요하다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 조각의 시퀀스와 길이가 모두 효율성에 영향을 줄 수 있기 때문에 구도를 개발할 때 몇 가지 문제 해결이 필요할 수 있음을 나타냅니다.

전반적으로, 이 연구는 옥수수 묘목의 농약이 2개의 다른 RNA 식물 바이러스, 다중 벡터 구성 및 옥수수의 11개의 유전자형에 대한 효과적인 접종 방법임을 보여주었습니다. 이러한 작업은 옥수수 클로로틱 몰틀 바이러스(MCMV) 또는 MSV와 함께 주사를 활용하는 전작과 결합된 FoMV 및 SCMV와 함께 작용하여, 암골주입이 RNA와 DNA 바이러스 의 전염성 클론으로 옥수수 묘목을 접종하는 데 적합하다는 것을 나타냅니다19,20,21,22. 또한, 이 작품은 농사주입이 VIGS 및 VOX 벡터에 대한 실행 가능한 방법이며 4일 된 식물에 적용될 수 있다는 것을 보여준다(표 3). 여기에 제시된 프로토콜은 일시적인 유전자 침묵(VIGS) 및 과발현(VOX)과 관련된 기능성 유전체학 연구에서 연구를 용이하게 하기 위해 옥수수 생물학자에 의해 쉽게 적응될 것으로 예상됩니다. 농사주는 또한 식물 변환에 의존하여 제한될 바이러스 기반 유전자 편집 접근법(VEdGE)을 용이하게 할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 잠재적으로 편집 효율뿐만 아니라 접근성^58,59,60을 개선할 수 있습니다. 적절한 농균 균주를 감안할 때, 옥수수 유전자형 및 바이러스 벡터가 신중하게 결합되어, 농경분에 의한 접종은 옥수수에서 일시적인 유전자 기능 분석을 위한 귀중한 도구가 될 것으로 기대된다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	Fisher Scientific	14955450	alternatively, BD 309659
15 mL Falcon Tubes	Corning Science	352059
1kb+ Ladder	ThermoFisher Scientific	10787018	For assessing sizes of PCR products
25G x 5/8" PrecisionGlide Needles	Becton, Dickinson and Company (BD)	305122
28°C Incubator			For Agrobacterium
37°C Incubator			For E. coli
Acetosyringone	MilliporeSigma	D134406	Optional
Agar	MilliporeSigma	A4800
Agarose	GeneMate	E-3120	For making gels to check for virus/insert stability
Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101			Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock
Bsu36I	New England Biolabs	R0524
cDNA Kit	ThermoFisher Scientific	K1672	Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase
Chloroform	Fisher Scientific	C298	For RNA extraction
Cuvettes	Fisher Scientific	14955127	1.5 mL
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7528	Alkaline Lysis
DH5alpha Competent E. coli Cells	New England Biolabs	C2987
DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	K1422	Rapid DNA Ligation Kit
EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate)	Fisher Scientific	S311	Alkaline Lysis
Ethanol			For RNA extraction
Fertilizer			Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate
Flat Inserts	T.O. Plastics	715357C	For germinating seeds in trays
Flats	T.O. Plastics	710245C	For germinating seeds in trays
FluorCam	Photon Systems Instruments		To assess maize plants for GFP expression before microscope
Fluorescence Microscope
Gel Electrophoresis Box
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918
Glacial Acetate	Fisher Scientific	A38	Alkaline Lysis
Glycerol	Fisher Scientific	G33-500	For saving frozen stocks of bacteria
Go-Taq, 2X	Promega	M7123
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144	for pHing solutions
Isopropanol	Sigma-Aldrich	109827	For RNA extraction
Kanamycin, Monosulfate	Fisher Scientific	BP906
Large Pots	Kordlok	SQL0550	5x5x4" or bigger.  For transplanting seedlings.
Luria Bertani (LB) Broth, Miller	Himedia	M1245
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Amresco	662
Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed	American Meadows, West Coast Seeds
Maize Inbred Seed			Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers.
Maxima H Minus Reverse Transcriptase	ThermoFisher Scientific	EP0753
MilliQ	Elga		Purelab Ultra
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit	New England Biolabs	T1030
PacI	New England Biolabs	R0547
Peters Excel 15-5-15 Fertilizer	ICL Specialty Fertilizers	G99140
Petri Dish, 95 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875714G
pH Meter
Potassium Acetate	Fisher Scientific	P171	Alkaline Lysis
Primers			Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT
PspOMI	New England Biolabs	R0653
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0491
Rifampicin	EMD Millipore Corp	557303
Rnase A	ThermoFisher Scientific	12091021	Alkaline Lysis
SbfI	New England Biolabs	R0642
Scale			For weighing chemicals for media or buffers
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Fisher Scientific	BP166	Alkaline Lysis
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318	Alkaline Lysis
Soil Substrate	SunGro Horticulture	SS#1-F1P	Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient
Spectrophotometer			For measuring OD600
Sybr Safe, 10,000X	Invitrogen	S33102	For making gels to check for virus/insert stability
Thermocycler			For PCR
Tris Base	Fisher Scientific	BP154	Alkaline Lysis
Trizol	Ambion	15596018	For RNA extraction
Weigh Paper			For weighing chemicals for media or buffers
XbaI	New England Biolabs	R0145