오픈 소스 디지털 이미지 상관관계를 통한 힘줄의 국소 조직 변형 측정

요약

이 논문은 힘줄 외식편 내에서 국소 2D 조직 변형을 측정하기 위한 오픈 소스 디지털 이미지 상관 알고리즘에 대해 설명합니다. 이 기술의 정확성은 여러 기술을 사용하여 검증되었으며 공개적으로 사용할 수 있습니다.

초록

힘줄 세포가 현장에서 경험하는 균주와 이러한 균주가 조직 리모델링에 미치는 영향을 이해하는 데 상당한 과학적 관심이 있습니다. 이러한 관심을 바탕으로, 로딩 동안 힘줄 외식편 내의 국소 조직 변형을 측정하기 위한 몇 가지 분석 기술이 개발되었습니다. 그러나, 몇몇 경우에, 이들 기술들의 정확성 및 민감도는 보고되지 않았으며, 알고리즘들 중 어느 것도 공개적으로 이용가능하지 않다. 이로 인해 힘줄 외식편에서 국소 조직 변형을 보다 광범위하게 측정하는 것이 어려워졌습니다. 따라서 이 논문의 목적은 쉽게 사용할 수 있고 사용하기 쉬운 힘줄 외식편에서 국소 조직 변형을 측정하기 위한 검증된 분석 도구를 만드는 것이었습니다. 특히, 공개적으로 사용 가능한 ALDIC(Augmented-Lagrangian Digital Image Correlation) 알고리즘은 단축 장력 하에서 마우스 아킬레스건 내 세포핵의 변위를 추적하여 2D 변형을 측정하는 데 적용되었습니다. 또한, 계산된 균주의 정확도는 디지털로 변환된 이미지를 분석하고 변형을 독립적인 기술(즉, 광표백 선)에서 결정된 값과 비교하여 검증되었습니다. 마지막으로, 계산된 변위 필드를 사용하여 참조 이미지를 재구성하는 기술이 알고리즘에 통합되었으며, 이는 알려진 변형률 값 또는 2차 측정 기술이 없는 경우 알고리즘의 정확도를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 알고리즘은 0.00015의 정확도로 최대 0.1의 변형률을 측정할 수 있습니다. 재구성된 참조 이미지를 실제 참조 이미지와 비교하는 기술은 잘못된 데이터가 있는 샘플을 성공적으로 식별했으며 데이터가 좋은 샘플에서 변위 필드의 약 85%가 정확함을 나타냅니다. 마지막으로, 마우스 아킬레스건에서 측정된 균주는 이전 문헌과 일치했습니다. 따라서 이 알고리즘은 힘줄의 국소 조직 변형을 정확하게 측정하는 데 매우 유용하고 적응력이 뛰어난 도구입니다.

서문

힘줄은 기계적 하중 1,2,3,4에 반응하여 적응하고 퇴화하는 기계에 민감한 조직입니다. 힘줄 세포 생물학에서 기계적 자극이 하는 역할로 인해 로딩 중에 힘줄 세포가 천연 조직 환경에서 경험하는 균주를 이해하는 데 큰 관심이 있습니다. 힘줄의 국소 조직 변형을 측정하기 위해 몇 가지 실험 및 분석 기술이 개발되었습니다. 여기에는 스페클 패턴 또는 광표백 선(PBL)^을 사용한 표면 변형의 2D/3D 디지털 이미지 상관관계(DIC) 분석^{5,6,7,8, 조직 내} 개별 핵의 중심 대 중심 거리 변화 측정(^9,10), 면외 운동 및 3D 변형을 고려하는 최근의 전체 필드 3D DIC 방법이 포함됩니다 ¹¹

프로토콜

이 연구는 펜실베니아 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 조직 준비

1. 이 프로토콜을 위해 2-4개월 된 수컷 C57BL/6 마우스에서 아킬레스건을 채취합니다.
   참고: 생쥐나 다른 작은 동물의 다른 힘줄이나 인대도 사용할 수 있습니다.
   1. 아킬레스건 표면의 피부를 절개하여 족저힘줄과 주변 결합조직을 노출시킵니다. 그런 다음 수술용 칼날을 사용하여 제거합니다.
   2. 노출된 가자미근과 비복근을 뒷다리에서 분리하고 수술용 칼날로 아킬레스건을 조심스럽게 긁어냅니다
   3. 회전 도구에 절단 휠 부착물을 사용하여 발의 나머지 부분에서 종골을 분리합니다.
2. 실온에서 회전 믹서에서 5-(4,6-디클로로트리아지닐) 아미노플루오레세인(DTAF) 및 0.1M 중탄산나트륨 완충액의 5μg/mL 용액 1.5mL에 조직을 20분 동안 염색합니다. 이 용액은 조직에서 단백질(예: 세포외 기질)을 염색합니다.
   참고: 이 20분 동안 1.3단계를 완료해야 합니다.
3. 인산염 완충 식염수(PBS)에 DRAQ5의 1:1,000 용액을 준비하여 핵을 염색합니다. 와류 믹서를 사용하여 용액을 균질화하십시오....

결과

실제 조직 샘플의 변형 필드를 분석하기 전에 ALDIC 프로토콜은 먼저 마우스 아킬레스건 내 핵의 디지털 변형/변환 이미지를 사용하여 검증되었습니다. 구체적으로, 이미지는 시뮬레이션된 푸아송 비율 1 ^15,16으로 2%, 4%, 6%, 8% 및¹⁰% 변형률의 x 방향으로 균일한 변형을 디지털 방식으로 생성하도록 변환되었습니다. 그런 다음 ALDIC 알고리즘의 정확도는 평균.......

토론

이 논문의 목적은 인장 하중 하에서 힘줄의 2D 변형률을 측정하기 위한 오픈 소스의 검증된 방법을 제공하는 것이었습니다. 소프트웨어의 기초는 공개적으로 이용 가능한 ALDIC 알고리즘¹²을 기반으로합니다. 이 알고리즘은 증분(누적) 변형률 분석의 기능이 추가된 더 큰 MATLAB 코드에 포함되었습니다. 이 적응 된 알고리즘은 힘줄의 인장 시험에 적용되었으며, 그 정확도는 두 가지 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer	ThermoFisher	D16
Calipers	Mitutoyo	500-196-30
Confocal Microscope	Nikon	A1R HD
Corning LSE Vortex Mixer	Coning	6775
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)	ThermoFisher	62554
MATLAB	MathWorks	R2022b
Tensile Loading Device	N/A	N/A	Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13)
Tube Revolver Rotator	ThermoFisher	88881001