성체 마우스에서 측면 꼬리 정맥 주입을 통한 아데노 관련 바이러스의 일관된 전달

요약

여기에서는 성체 마우스에서 아데노 관련 바이러스(AAV)를 체계적으로 투여하기 위해 마우스 측면 꼬리 정맥 주입에 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한 AAV transduction을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

많은 질환이 여러 장기에 영향을 미치거나 신체의 다른 부위를 침범하기 때문에 서로 다른 부위에 위치한 영향을 받은 세포를 표적으로 하기 위해 전신적으로 치료제를 제공하는 것이 중요합니다. 정맥 주사는 전신 투여를 목적으로 하는 치료법을 평가하는 전임상 연구에서 널리 사용되는 전신 전달 경로입니다. 성체 마우스의 경우, 치료제를 마우스의 측면 꼬리 정맥에 정맥 투여하는 것을 포함합니다. 숙달되면 꼬리 정맥 주사는 안전하고 빠르며 간단하고 일반적으로 사용 가능한 도구만 있으면 됩니다. 그러나 꼬리 정맥 주사는 기술적으로 까다로우며 의도한 용량의 정확한 전달을 보장하기 위해 광범위한 교육과 지속적인 연습이 필요합니다.

여기에서 우리는 우리의 경험과 이전에 다른 그룹에서 보고한 권장 사항을 기반으로 개발한 상세하고 최적화된 측면 꼬리 정맥 주사 프로토콜에 대해 설명합니다. 마우스 억제 장치와 인슐린 주사기를 제외하고 이 프로토콜에는 대부분의 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 시약과 장비만 필요합니다. 우리는 이 프로토콜을 따르면 진정되지 않은 7-9주 된 마우스의 꼬리 정맥으로 아데노 관련 바이러스(AAV)가 일관되게 성공적으로 전달된다는 것을 발견했습니다. 또한 AAV transduction 및 biodistribution을 평가하는 데 사용되는 이배체 게놈(vg/dg)당 벡터 게놈 및 형광 리포터 단백질의 조직학적 검출을 위한 최적화된 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 실험자가 꼬리 정맥 주입을 성공적이고 일관되게 쉽게 수행할 수 있도록 도와 기술을 마스터하는 데 필요한 연습 시간을 줄일 수 있도록 돕는 것입니다.

서문

단일 유전자 질환은 희귀 질환의 80%를 차지하며, 전 세계적으로 3억 명이 앓고 있습니다 ^1,2. 현재 이러한 크게 쇠약해지는 희귀 질환의 대다수에 대해 승인된 치료법은 없습니다 ^1,2,3. 그러나 단일 유전자 장애는 역기능 유전자를 대체, 보충, 교정 또는 침묵시킬 수 있는 유전자 치료의 이상적인 후보입니다 ^4,5. 현재 여러 벡터가 개발되어 특정 세포 유형에 유전자 치료를 전달하는 데 사용되고 있습니다 ^4,6. 이러한 벡터 중 하나는 아데노 관련 바이러스(AAV)입니다. AAV는 비병원성 파보바이러스(non-pathogenic parvovirus)로, 유전자 치료 벡터로 점점 더 많이 사용되고 있다⁷. 다른 바이러스 벡터와 비교했을 때, AAV는 면역원성이 낮고, 숙주 게놈에 통합될 가능성이 낮으며, 다양한 조직에서 분열 및 비분열 세포를 효율적으로 transduction할 수 있는 능력을 가지고 있습니다 ^7,8. 또한, 특정 조직 영양성 또는 더욱 감소된 면역원성과 같은 바람직한 특성을 가진 AAV를 엔지니어링하고 식별하기 위한 여러 접근법이 개발되었으며, 이는 다양한 적응증에 대한 바이러스 벡터로서 AAV의 다양성을 크게 향상시킵니다⁹. 이러한 요인들로 인해 AAV는 널리 연구되는 유전자 치료 벡터가 되었으며, FDA가 승인한 여러 AAV 기반 유전자 치료법의 개발로 이어졌습니다¹⁰.

마우스 모델은 일반적으로 생체 내에서 잠재적인 유전자 치료법을 테스트하고 단일 유전자 질환의 병리 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 사용됩니다. 이는 마우스 모델이 다양한 조건의 병리학을 재현하고, 인간 게놈과 게놈의 유사성, 마우스 취급, 유지 관리 및 생성의 상대적 용이성 때문입니다 11,12,13. In vivo testing은 근육 이영양증과 같이 신체의 여러 시스템 또는 영역에 영향을 미치는 장애를 연구할 때 특히 중요합니다. 이러한 질환의 경우, 체외 검사는 전신 투여 후 다양한 신체 부위에 도달하도록 의도된 치료제의 안전성, 효능, 약동학 및 약력학을 종합적으로 평가하기에 충분하지 않을 수 있다¹⁴.

약물을 전달하기 위해 다양한 전신 투여 경로를 사용할 수 있습니다. 각 경로에는 장점, 단점, 연구 대상 동물모델 및 약물과의 호환성 정도가 있다¹⁵. 정맥 주사(IV) 측면 꼬리 정맥 주입은 마우스¹⁶에서 AAV의 전신 전달을 위해 일반적으로 사용되는 경로입니다. 측면 꼬리-정맥 주사는 주사액을 마우스 혈류에 빠르고 직접 투여할 수 있게 하여 전신 순환에서 높은 약물 생체이용률을 보장한다¹⁷. 또한 비교적 간단하고 일반적으로 사용 가능한 도구를 수행해야 합니다. 그러나 주로 꼬리 정맥 직경이 작고 정맥을 찾기 어렵기 때문에 외측 꼬리 정맥 주사는 기술적으로 까다롭고 주사 시도 실패 또는 불완전한 용량 전달을 피하기 위해 높은 수준의 기술과 지속적인 연습이 필요합니다 16,17,18,19. 이로 인해 값비싼 시약이 손실되거나 부정확한 결과가 발생할 수 있으며, 특히 주입을 수행하는 동안 불완전한 주입이 인식되지 않는 경우 더욱 그렇습니다. 여기에 요약된 우리의 경험은 우리의 사용에 맞게 조정한 잘 문서화된 기사에 보고된 프로토콜을 기반으로 하며, 일관되게 성공적인 주입을 보장하기 위해 측면 꼬리 정맥 주입 절차의 다양한 단계를 최적화합니다 20,21,22,23,24,25,26,27.

여기에서는 간단하고 일반적으로 사용 가능한 도구를 사용하여 진정되지 않은 7-9주 된 마우스에 AAV를 전달하기 위해 최적화된 측면 꼬리 정맥 주입 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 또한, 당사는 AAV 전달 및 생체 분포를 평가하는 데 사용되는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 주입 후 조직 수집, 조직 고정, DNA 추출 및 이배체 게놈(vg/dg)당 디지털 중합효소 연쇄 반응(dPCR) 벡터 게놈을 다룹니다. 여기에 제공된 IV 주입 프로토콜 및 지침은 측면 꼬리 정맥 주입을 성공적으로 수행하는 용이성을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 이는 주입 기술을 습득하는 데 필요한 시간을 줄이는 동시에 주입의 정확성과 일관성을 향상시키는 데 잠재적으로 도움이 될 것입니다.

프로토콜

모든 동물 취급 및 주사 절차는 NINDS의 동물 보호 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 동물 시술은 NINDS 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 주입 전 준비

1. AAV 용량 준비
   1. 주입할 마우스의 평균 체중을 결정합니다.
   2. 방정식 (1)과 같이 기관의 동물 관리 지침에 따라 최대 허용 주입량을 계산합니다. 최대 주입 부피는 일반적으로 부피(μL)/마우스 무게(g) 값(예: 10μL/g)입니다.
      최대 주입량(μL)/mouse= (최대 주입량(μL/g)) ×(평균 마우스 체중(g)) (1)
      참고: 샘플 계산: 최대 주입량/마우스 = 10 μL/g × 20 g/마우스 = 200 μL/마우스
   3. 마우스당 전달할 AAV 벡터 게놈(vg) 투여량을 설정합니다.
      참고: 이것은 다른 마우스에서 동일한 절대값일 수 있습니다(예: 각 마우스의 무게에 관계없이 모든 마우스는 1.5 ×^{10 12} vg를 받습니다). 또는 투여량은 vg/kg 단위일 수 있으므로 마우스당 주입할 총 vg는 주사 날짜에 해당 마우스의 체중에 따라 각 마우스에 대해 계산해야 합니다.
      1. 투여량이 vg/kg 단위인 경우, 투여량 준비 전에 주사일에 각 마우스의 무게를 잰다.
      2. 방정식 (2)를 사용하여 체중에 따라 각 마우스에 대해 전달될 벡터 게놈을 계산합니다.
         특정 마우스에서 전달되는 벡터 게놈(vg) = 사전 지정된 vg/kg 값(vg/kg) × (2)
         참고: 특정 전임상 연구에서는 주입된 투여량 간의 유효한 비교를 보장하기 위해 vg/mouse 대신 vg/kg을 투여량 단위로 사용하는 것이 더 적절할 수 있습니다. 이것은 같은 나이의 수컷과 암컷 쥐 사이 또는 아마도 같은 성별의 마우스 사이의 체중 차이 때문입니다.
      3. 최대 주입 용량과 AAV(vg) 용량을 사용하여 필요한 용량을 준비하는 데 필요한 스톡 AAV 및 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)의 용량을 계산합니다(방정식 (3-6) 참조). 주입할 부피가 허용된 최대 주입 부피와 같거나 작은지 확인하십시오. 항상 피펫팅 오류와 주사기 데드 스페이스를 고려하여 주입할 부피보다 최소 15 μL 더 큰 주입 부피를 준비하십시오.
         주입액 농도(vg/μL) = (3)
         주입제를 준비하기 위해 추가할 총 AAV 벡터 게놈(vg) = 주입제의 농도(vg/μL) × 준비할 부피(μL)(4)
         주사액을 준비하기 위해 추가할 AAV 스톡의 부피) (μL) = (5)
         주입액을 준비하기 위해 추가할 PBS의 부피(μL) = 준비할 부피(μL) - 주입액을 준비하기 위해 추가할 AAV 스톡의 부피(μL)(6)
         참고: 샘플 계산:
         6 × 10¹³ vg/kg(용량)은 무게가 25g인 마우스에서 200 μL/마우스(주입할 부피)로 전달됩니다. AAV 스톡 역가는 3.0 ×^{10 13} (vg/mL)입니다.
         이 특정 마우스에서 전달될 벡터 게놈(vg) = 6 ×^{10 13}(vg/kg) × = 1.5 × 이 마우스에 대해 10¹² vg
         주입액의 농도 = = 7.5 × 10⁹ (vg/μL)
         주사액을 준비하기 위해 추가할 총 AAV 벡터 게놈 = 7.5 × 10⁹ (vg/μL) × (200 (μL) + 15 (μL)) = 1.6125 × 10¹² (vg)
         주입액을 준비하기 위해 추가할 AAV 스톡의 부피 = = 53.75 (μL)
         주입액을 준비하기 위해 추가할 PBS의 부피 = 215 (μL) - 53.75 (μL) = 161.25 (μL)
   4. AAV 용량 준비 절차
      참고: AAV 취급에 대한 기관의 생물안전성 및 PPE 지침에 따라 오토클레이브 멸균 RNase-free 및 DNase-free 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에서 1.1.3.3단계의 계산에 따라 AAV 스톡 및 멸균 PBS를 사용하여 AAV 주사액을 준비합니다. 항상 스톡 AAV 및 AAV 주사를 얼음에 보관하십시오. 깨끗한 마이크로피펫과 새로운 마이크로피펫 팁 상자를 사용하여 멸균을 보장하십시오. AAV에 오염된 마이크로피펫 팁은 기관의 폐기물 관리 지침에 따라 폐기하십시오.
      1. 육수 AAV를 얼음에서 해동합니다.
         알림: AAV 스톡을 해동 및 재냉동하지 마십시오. 100-200 μL의 부분 표본으로 AAV 재고를 주문하거나 준비하여 복용량 준비 후 재냉동해야 하는 과도한 AAV가 발생하지 않도록 하십시오.
2. 주입 스테이션 준비
   1. 청소
      1. 70% 에탄올(EtOH)로 작업 영역을 청소합니다.
      2. 살균, 살균 및 바이러스 시약을 사용하여 작업 영역을 소독합니다.
      3. 마우스 튜브 조절 장치를 물과 비누로 청소하십시오.
   2. 스테이션 도구 설정
      1. 깨끗하고 빈 15mL 원뿔형 튜브를 튜브 홀더/랙에 넣습니다.
      2. 마우스 튜브 고정 장치가 배치될 높은 플랫폼을 설정합니다(그림 1A,B).
      3. 깨끗한 마우스 튜브 고정 장치를 작업 영역에 놓습니다.
      4. 사용 가능한 마우스 튜브 억제 장치보다 훨씬 작은 마우스를 주입하는 경우 플라스틱 설치류 억제 원뿔을 사용하여 구속 슬리브를 만드십시오. 2.1.3-4단계를 참조하십시오.
      5. 주입에 사용할 주사기를 작업 영역에 놓습니다. 29G 바늘과 함께 0.3mL 인슐린 주사기를 사용합니다.
      6. AAV에 오염된 도구를 즉시 폐기할 수 있도록 폐기물 용기를 주입 스테이션에 가능한 한 가깝게 배치하십시오.
      7. 각 주사기의 플런저를 여러 번 당기고 밀어 플런저가 부드럽게 움직이는지 확인하여 주입 중에 주사기로 인한 저항이 없도록 합니다. 플런저가 부드럽게 움직이지 않으면 이 주사기를 폐기하고 새 주사기로 교체하십시오.
      8. 주입 부위 옆에 마우스 스케일과 미니 원심분리기를 준비하십시오.
      9. 준비된 AAV를 얼음에 올려 주사 부위에 준비합니다.
      10. 따뜻한 물(38-40 °C)을 준비합니다. 쥐 꼬리에 화상을 입지 않도록 수온이 40°C를 초과하지 않도록 주의하십시오.

2. 주입 절차

1. 마우스 제지
   1. 필요한 경우 각 마우스의 무게를 측정하여 vg/kg 단위의 복용량을 계산합니다.
   2. 마우스가 완전히 고정되어 움직일 수 없는지 확인하십시오.
      알림: 마우스가 완전히 구속되지 않은 경우 IV 투여 중에 마우스가 움직여 바늘이 변위될 수 있습니다. 이로 인해 바늘이 정맥에서 빠져나가거나 마우스가 다칠 수 있습니다.
   3. 튜브 구속구의 경우:
      1. 마우스 사이에 따뜻한 물과 비누로 구속 장치를 세척하여 홀더를 청소하고 예열하십시오.
      2. 마우스의 꼬리를 잡습니다. 쥐의 꼬리를 튜브의 상단 구멍에 삽입합니다. 그런 다음 마우스를 튜브 고정 장치 안으로 천천히 당겨 넣습니다. 튜브 조절기의 크기가 마우스 크기에 적합한 경우 플러그를 마우스 앞에 놓아 마우스가 빠져나가지 않도록 합니다.
         알림: 플러그는 마우스가 튜브 내부에서 움직이거나 회전하는 것을 방지할 수 있을 만큼 마우스에 충분히 가까워야 하지만 마우스가 자유롭게 숨을 쉴 수 있도록 플러그가 마우스의 코를 막지 않아야 합니다. 마우스가 튜브 레스트레인터 크기보다 작은 경우 아래 2.1.4단계에서 설명한 대로 튜브 레스트레인 외에 유연한 일회용 레스트레이너 콘을 사용하십시오.
   4. 필요한 경우 유연한 일회용 억제 원뿔의 경우(더 작은 마우스를 위한 구속 슬리브를 만들기 위해):
      1. 원뿔의 코 끝을 잘라 쥐의 코가 막히지 않고 쥐가 숨을 쉴 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인합니다.
      2. 원뿔이 마우스와 거의 같은 길이가 되도록 원뿔의 뒷면을 자릅니다(원뿔이 튜브 내부에 맞도록)(그림 1A, B).
      3. 위의 2.1.3단계에서 설명한 대로 튜브 고정 장치에 마우스를 놓습니다. 마우스의 꼬리를 잡고 더 넓은 열림면이 있는 구속 콘을 먼저 튜브에 삽입합니다.
      4. 쥐의 꼬리를 잡고 마우스가 원뿔 안으로 걸어 들어가도록하십시오. 그런 다음 원뿔의 나머지 부분을 튜브에 밀어 넣습니다. 마우스의 꼬리가 튜브 뒤쪽에서 완전히 빠져 나오고 마우스가 원뿔 내부에서 숨을 쉴 수 있는 공간이 있는지 확인합니다.
      5. 원뿔의 코 개구부 바로 앞에 튜브 플러그를 고정하고 마우스가 완전히 구속되어 있고 숨을 쉴 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인합니다.
2. 마우스 주입
   1. 15mL 원뿔형 튜브에 따뜻한 물을 채웁니다.
   2. 마우스가 들어 있는 튜브 고정 장치를 높은 플랫폼에 놓습니다(그림 1B).
   3. 측면 정맥이 명확하게 확장되고 보일 때까지 구속된 쥐의 꼬리를 따뜻한 물에 가능한 한 많이 담그십시오(그림 1B).
   4. 꼬리 워밍 단계에서 AAV 투여량을 주사기에 로드합니다.
      1. 뚜껑을 닫지 않은 AAV 함유 1.7mL 미세 원심분리기 튜브를 튜브 랙에 넣습니다. 주로 사용하는 손으로 바늘을 튜브에 수직으로 삽입합니다. 바늘이 튜브 안에 들어가면 자주 사용하지 않는 손으로 튜브를 잡습니다.
         알림: 바늘을 수직으로 삽입하면 튜브 벽을 만져 발생할 수 있는 바늘 손상을 방지할 수 있습니다. 다른 대체 주사기 로딩 방법을 사용할 수 있지만 실험자와 주입된 마우스의 안전성이 보장되어야 합니다. 자주 사용하지 않는 손으로 튜브를 잡으면 튜브를 잡고 있는 동안 바늘을 삽입할 경우 우발적인 바늘 찔림 부상을 방지할 수 있습니다.
      2. 바늘을 튜브 안에 넣은 상태에서 바늘이 튜브 벽에 닿지 않도록 하면서 튜브와 주사기를 동시에 눈높이까지 올립니다. 두 팔을 테이블 위에 올려 안정시킵니다. 투여량을 주사기에 천천히 집어넣습니다.
         알림: 느린 흡인은 미세한 기포가 주사기 배럴 측면에 부착되는 것을 방지합니다.
      3. 주사기에서 기포를 배출합니다. AAV를 주입하는 경우 생물학적 위험 상자에 폐기할 일회용 흡수 패드를 통해 주사기에서 기포가 배출되었는지 확인하십시오.
      4. 주사액을 40초 이상 유지하여 예열합니다.
         알림: 주입하기 전에 항상 주입액이 따뜻한지 확인하십시오. 콜드 주사를 투여하면 처음 몇 μL를 제외하고는 주사가 정맥을 통해 흐르지 않을 수 있습니다.
      5. 매분마다 꼬리 정맥을 확인하십시오.
         참고: 정맥은 주사 부위까지 매우 잘 보여야 합니다(정맥이 명확하게 보일 때까지 꼬리 예열 시간을 추가하고 필요에 따라 신선한 따뜻한 물로 교체하되 기관의 동물 취급 프로토콜에서 허용하는 마우스 구속 시간을 초과해서는 안 됨).
      6. 정맥이 명확하게 보이는지 확인한 후 높은 플랫폼 상단에서 튜브 고정 장치를 제거하고 튜브 고정 장치를 테이블 위에 직접 놓습니다. 꼬리를 쉽게 다룰 수 있도록 발을 옆이 아닌 아래쪽으로 하여 마우스를 억제 장치에 놓습니다.
         알림: 마우스는 옆으로 눕거나 억제 장치 내부에 뒤로 있어서는 안 됩니다. 마우스는 완전히 구속되어야 하며 구속 장치 내에서 움직이거나 회전하거나 꼬리를 움직이거나 당길 수 없어야 합니다.
      7. 거즈로 꼬리를 빠르게 닦아 꼬리를 말리십시오. 알코올 면봉으로 꼬리를 닦은 후 마른 거즈로 물기를 닦아냅니다.
         알림: 마른 거즈를 사용하여 꼬리를 단단히 잡을 수 있을 만큼 충분히 건조시키되 완전히 건조되지는 않도록 하십시오. 꼬리가 완전히 건조되면 정맥을 보는 것이 더 어려울 수 있습니다.
      8. 꼬리를 왼쪽이나 오른쪽으로 약 90° 회전하여 두 개의 측면 정맥 중 하나가 위쪽을 향하도록 합니다. 꼬리의 중간 1/3 이내에 적합한 주사 부위를 찾습니다. 초기 주입을 원위(꼬리 끝에 더 가까움)로 시작하고 실패한 시도로 인해 추가 주입이 필요하거나 실험 설계에 의해 필요한 경우 근접하게 이동합니다.
         알림: 주사액이 이전 주사 부위에서 누출될 수 있으므로 이전 주사 부위에 원위부로 주사를 시도하지 마십시오. 선택 사항: 주로 사용하지 않는 손의 엄지와 검지를 사용하여 주사 부위에 10초 동안 근접(마우스 본체에 상류/더 가까운)에 압력을 가합니다. 손가락은 주사 부위의 정맥을 더욱 확장시키는 지혈대 역할을 합니다. 10초 지혈대 직후 지혈대 손가락을 놓고 두 측면 정맥 중 하나가 위쪽을 향하고 명확하게 보이는지 확인합니다.
      9. 주로 사용하지 않는 손으로 엄지와 검지를 주사 부위 바로 원위부에서 사용합니다. 주사 부위가 집게 손가락에 평평하게 놓이도록 꼬리를 집게 손가락 위로 접습니다. 꼬리가 늘어나고 주입 부위가 완전히 수평(0°에서)이 되도록 꼬리를 뒤로 당깁니다(수평 테이블과 평행)(그림 1C).
      10. 주사기의 배럴 플랜지 양쪽에 있는 우세한 손의 검지와 중지를 사용하여 주사기를 잡고 엄지 손가락을 플런저에 준비합니다.
          알림: 이렇게 하면 바늘이 정맥 내부에 들어가면 엄지손가락이나 바늘을 움직이지 않는 것이 더 쉬워집니다(그림 1C).
      11. 양손을 테이블 위에 올려 안정시키고 바늘을 경사가 위쪽을 향하도록 하여 꼬리와 정맥에 직접 평행하게 놓습니다. 주사 부위의 제어력과 안정성을 향상시키기 위해 꼬리를 잡고 있는 검지 손가락에 주사 부위를 가깝게 유지하십시오.
          알림: 튜브 고정 장치는 두 손이 테이블에서 지지될 수 있도록 테이블에서 충분히 깊숙이 있어야 합니다.
      12. 바늘을 꼬리 정맥과 평행하게 유지하고 바늘에 아래쪽 압력을 가하면서 바늘을 정맥 쪽으로 앞으로 밀어 넣습니다.
          알림: 하향 압력은 바늘을 정맥에 올바른 각도로 삽입하기에 충분해야 합니다. 정맥은 매우 얕기 때문에 정맥에 들어가려고 할 때 바늘은 가능한 한 평평해야 합니다.
      13. 용액을 정맥에 천천히 주입하십시오. 투여 후 천천히 바늘을 빼고 즉시 주사 부위에 거즈로 10초 이상 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다.
          알림: 주입된 시약의 잠재적인 손실을 방지하기 위해 출혈이 완전히 멈출 때까지 필요한 만큼 압력을 가하십시오. 핏방울은 일반적으로 바늘을 빼낸 후에 나타나며 바늘이 정맥을 관통했음을 나타냅니다. 간혹 주사를 성공적으로 맞아도 핏방울이 나오지 않는 경우가 있습니다. 혈액 방울은 성공적인 주입을 나타내지 않습니다. 바늘이 정맥을 관통했다는 것을 나타낼 뿐입니다. 신뢰할 수 있는 성공적인 주입 지표는 주입 중 플런저 저항이 완전히 없다는 것입니다. 바늘이 정맥 내부에 있는 경우 주사액을 주입하는 동안 바늘 플런저에 저항이 없어야 하며 주사 부위에 근접한 정맥이 일시적으로 약간 밝은 색(반점)으로 나타납니다(일부 마우스 균주에서는 정맥 희시가 명확하지 않을 수 있음). 저항이 있거나 주사 부위에 돌출부가 나타나기 시작하면 바늘이 정맥 내부에 올바르게 배치되지 않은 것입니다. 이 경우 꼬리에서 바늘을 완전히 제거하고 실패한 주사 부위(마우스 본체에 더 가까움)에 근접한 새로운 주사 부위에 정맥을 주입하려고 시도합니다.
      14. AAV에 오염된 주사기와 튜브는 기관의 폐기물 관리 지침에 따라 폐기하십시오.
      15. 구속 장치에서 마우스를 풀어주고 주입되지 않은 마우스와 분리된 새 케이지에 다시 넣습니다. 주입 후 정상적인 활동 수준을 확인하기 위해 10분 동안 마우스를 모니터링합니다.
          참고: 이는 전염성 약물을 투여하는 경우 주입된 약물이 주입되지 않은 마우스로 전염될 가능성을 방지합니다.
      16. 살균, 살균 및 바이러스 시약과 70% EtOH를 사용하여 작업 영역을 소독합니다. 마우스 튜브 조절 장치를 물과 비누로 청소하십시오.

3. 해부 및 조직 채취 및 고정²⁷

1. 조직 수집 스테이션 준비
   1. 작업 영역에 존재할 수 있는 오염된 DNA를 분해하기 위한 제조업체의 지침에 따라 DNA 분해 시약으로 작업 스테이션을 청소합니다.
   2. 금속 용기에 메틸부탄을 넣습니다. 메틸부탄 금속 용기를 스티로폼 상자 안에 넣습니다. 그런 다음 금속 용기를 드라이 아이스로 둘러싸서 용기를 둘러싼 드라이 아이스의 수준이 용기 내부의 메틸 부탄 수준보다 높도록합니다.
   3. 라벨을 붙이고 빈 2mL 마이크로 원심분리기 조직 보관 튜브를 드라이아이스 위에 놓습니다. 메틸부탄과 조직 보관 튜브를 드라이아이스에서 최소 20분 동안 식힌 후 티슈를 얼리기 시작합니다. 조직 이송 겸자를 드라이 아이스 위에 놓습니다.
   4. 다른 2mL 마이크로 원심분리기 조직 보관 튜브 세트에 라벨을 붙이고 새로운 4% 파라포름알데히드(PFA)를 채우고 실온에서 보관합니다. 튜브에 넣을 조직을 완전히 담글 수 있도록 각 튜브에 충분한 4% PFA를 추가합니다.
2. 조직 채취 및 고정
   1. 기관의 동물 보호 지침에 따라 쥐를 안락사시킵니다.
      참고: 여기에서 쥐는 자궁경부 탈구를 사용하여 안락사되었습니다.
   2. 마우스에 70% EtOH를 완전히 분무합니다.
   3. 필요한 조직을 수집합니다.
      참고: 여기에 설명된 수집 및 고정 프로토콜은 골격근과 간에서 테스트되었습니다.
   4. DNA 추출에 사용될 조직의 경우:
      1. 드라이아이스에 미리 냉각된 메틸부탄에 티슈를 떨어뜨리고 티슈를 메틸부탄에 최소 1분 동안 그대로 둡니다. 사전 냉각된 이송 겸자를 사용하여 메틸부탄의 동결 조직을 사전 냉각된 빈 2mL 미세 원심분리기 조직 보관 튜브로 옮깁니다. 티슈를 -80 °C에서 보관하십시오.
         참고: 선택 사항: 조직을 20mg 조각으로 자르기 전에 메틸부탄을 떨어뜨려 4.1.4단계에서 사용할 수 있도록 준비할 수 있습니다.
   5. 조직학적 분석 및 리포터 단백질의 형광 보존에 사용될 조직의 경우:
      1. 실온에서 보관된 PFA 지정 겸자를 사용하여 4% PFA(실온에서 보관)가 포함된 각각의 미세 원심분리기 튜브에 조직을 떨어뜨리고 조직이 4% PFA 용액에 완전히 잠겼는지 확인합니다.
         참고: PFA 오염은 다양한 다운스트림 분자 분석에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 다른 조직이나 도구의 PFA 오염을 방지하기 위해 PFA를 취급할 때만 PFA 지정 겸자를 사용하십시오.
      2. 마이크로 원심분리기 튜브를 랙에 놓고 랙을 호일 종이로 덮어 튜브를 어둡게 유지합니다. 뚜껑이 있는 랙을 4 °C에서 셰이커에 넣고 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다.
      3. 하룻밤 배양 후, 격렬한 흔들림으로 5.0g의 자당 70mL에 1x PBS를 용해시켜 1x PBS에 5% 자당(% w/v)을 준비합니다. 5% 자당 용액(% w/v)을 얻기 위해 최종 총 부피 100mL에 충분한 1x PBS를 추가합니다.
      4. 5μm 주사기 필터를 사용하여 0.22% 자당 용액을 멸균합니다. 2.0mL 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 갓 준비한 5% 자당을 채웁니다.
      5. 4% PFA의 조직을 5% 자당(실온에서 보관)이 포함된 각각의 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기면서 조직이 5% 자당 용액에 완전히 잠겼는지 확인합니다.
      6. 마이크로 원심분리기 튜브를 랙에 놓고 랙을 호일 종이로 덮어 튜브를 어둡게 유지합니다. 뚜껑이 있는 랙을 4 °C에서 셰이커에 넣고 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다.
      7. 하룻밤 배양 후, 격렬한 흔들림으로 1x PBS 70mL에 20.0g의 자당을 용해시켜 1x PBS에서 20% 자당(% w/v)을 준비합니다. 20% 자당 용액(% w/v)을 얻기 위해 최종 총 부피 100mL에 충분한 1x PBS를 추가합니다.
      8. 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 20% 자당 용액을 멸균합니다. 2.0mL 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 갓 준비한 20% 자당을 채웁니다.
      9. 5% 자당의 조직을 20% 자당(실온에서 보관)이 포함된 각각의 미세 원심분리 튜브로 옮기면서 조직이 20% 자당 용액에 완전히 잠겼는지 확인합니다.
      10. 마이크로 원심분리기 튜브를 랙에 놓고 랙을 호일 종이로 덮어 튜브를 어둡게 유지합니다. 뚜껑이 있는 랙을 4 °C에서 셰이커에 넣고 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다.
      11. 하룻밤 배양 후 메틸부탄을 금속 용기에 넣고 메틸부탄 금속 용기를 스티로폼 상자 안에 넣습니다. 금속 용기를 드라이 아이스로 둘러싸서 용기를 둘러싼 드라이 아이스 수준이 용기 내부의 메틸 부탄 수준보다 높도록합니다.
      12. 라벨을 부착하고 빈 2mL 미세 원심분리기 조직 보관 튜브를 드라이아이스 위에 놓습니다. 메틸부탄과 조직 보관 튜브를 드라이아이스에서 최소 20분 동안 식힌 후 티슈를 얼리기 시작합니다. 드라이 아이스 위에 이송 겸자를 놓습니다.
      13. 정밀 물티슈를 사용하여 조직을 빠르게 닦아내어 초과 20% 자당을 제거합니다. 드라이 아이스에 미리 냉각 된 메틸 부탄에 티슈를 떨어 뜨립니다. 조직을 메틸부탄에 최소 1분 동안 그대로 두십시오.
      14. 사전 냉각된 이송 겸자를 사용하여 메틸부탄의 동결 조직을 사전 냉각된 빈 2mL 미세 원심분리기 조직 보관 튜브로 옮깁니다. 티슈를 -80 °C에서 보관하십시오.

4. vg/dg 정량화를 위한 dPCR

1. 조직에서 DNA 추출 및 초기 RNA 분해
   참고: 재료 표 에 나열된 DNA 추출 키트의 핸드북은 이 DNA 추출 프로토콜을 도출하는 데 사용되었습니다. 얼린 티슈 조각이 들어있는 튜브는 항상 드라이 아이스에 보관하십시오.
   1. 얼음 양동이를 준비합니다.
   2. 각 DNA 샘플에 대해 1.5mL 용해 비드 튜브 1개와 빈 RNase-free 및 DNase-free 1.7mL 미세 원심분리기 튜브 2개를 라벨링합니다.
   3. 첫 번째 DNA 추출 키트 완충액 180μL를 각 비드 튜브에 추가합니다. 완충액을 함유하는 첫 번째 비드 튜브를 용기로 만듭니다.
      참고: 3.2.4.1단계에서 티슈를 미리 절단하지 않은 경우 드라이아이스에 미리 냉각된 면도날을 사용하여 티슈를 20mg 조각으로 자릅니다. 이 단계는 -20 °C 이하로 유지되는 깨끗한 저온 유지 장치 내에서 수행해야 합니다.
   4. 튜브에 조직 한 조각을 추가하십시오. 조직의 무게를 측정하고 기록합니다(~20mg).
   5. 조직이 들어 있는 용해 비드 튜브를 즉시 얼음 위에 놓습니다. 버퍼가 결정화될 수 있습니다.
   6. 각 조직 샘플에 대해 이전 단계를 반복합니다.
   7. 튜브를 용해 비드 튜브 블렌더로 옮기고 4°C에서 최대 속도(속도 10)로 1분 동안 실행합니다.
   8. 샘플을 얼음 위에 올려 원심분리기로 옮깁니다. 4°C에서 20,000× g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
   9. 원심분리 단계에서 1.7mL 미세 원심분리기 튜브의 첫 번째 시리즈에 20μL의 proteinase K를 추가합니다. 원심분리 단계 후, 균질액의 상층액을 proteinase K가 포함된 1.7mL 튜브로 옮기고 잘 섞는다. 56°C에서 500RPM으로 혼합하여 15분 동안 배양합니다.
   10. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다.
   11. 4 μL의 RNase A를 추가하고 간단한 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다. 15초 동안 펄스 소용돌이.
   12. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 두 번째 DNA 추출 키트 완충액 200μL를 추가합니다. 15초 동안 펄스 소용돌이.
   13. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 200μL의 100% EtOH를 첨가합니다. 15초 동안 펄스 소용돌이.
   14. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 용해물을 DNA 추출 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 6,000× g 에서 1분 동안 회전합니다.
   15. 스핀 컬럼을 새 수집 튜브에 넣습니다. 세 번째 DNA 추출 키트 완충액 500μL를 스핀 컬럼에 추가합니다. 6,000 ×g 에서 1분 동안 회전합니다.
   16. 스핀 컬럼을 새 수집 튜브에 넣습니다. 스핀 컬럼에 네 번째 DNA 추출 키트 완충액 500μL를 추가합니다. 20,000× g 에서 3분 동안 회전합니다.
   17. 스핀 컬럼을 새 1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 스핀 컬럼에 분자 등급 물 100μL를 추가합니다. 실온에서 1분 동안 배양합니다. 6,000× g 에서 실온에서 1분 동안 회전합니다.
   18. 필요한 경우 DNA 농도를 측정합니다. 단기 보관의 경우 4 °C, 장기 보관의 경우 -20 °C에서 보관하십시오.
2. FACS 분류 세포에서 DNA 추출
   참고: 재료 표 에 나열된 DNA 추출 키트의 핸드북은 이 DNA 추출 프로토콜을 도출하는 데 사용되었습니다.
   1. 세포를 분류한 후 샘플을 300× g 에서 5초 동안 원심분리하여 측면과 뚜껑에 있는 모든 방울을 수집합니다. 모든 방울이 수집되었는지 확인하십시오.
      참고: 시료 부피가 1.5mL 미만인 경우 다음 단계로 바로 진행하십시오. 시료 부피가 1.5mL보다 큰 경우 마이크로피펫을 사용하여 상층액의 상단 부분을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 샘플의 1-1.5mL를 남겨둡니다.
   2. 위아래로 여러 번 피펫팅하여 검체를 혼합하고 검체를 1.7mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 실온에서 515× g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
   3. 마지막 50 μL를 제외한 상층액을 폐기합니다. 펠릿을 첫 번째 DNA 추출 키트 완충액 50 μL에 재현탁시켜 최종 부피 100 μL를 만듭니다.
   4. 소량의 혈액에서 게놈 DNA를 분리하기 위한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오( 재료 표 참조).
      1. 10 μL의 proteinase K와 100 μL의 두 번째 DNA 추출 키트 완충액을 추가합니다. 15초 동안 펄스 소용돌이로 혼합합니다. 56°C에서 300RPM으로 혼합하여 10분 동안 샘플을 배양합니다. 이 배양 기간 동안 부드러운 반전으로 샘플을 두 번 혼합합니다.
      2. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 50μL의 100% EtOH를 첨가하고 15초 동안 펄스 볼텍싱으로 혼합합니다. 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
      3. 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 1-2초 동안 원심분리하여 튜브의 벽과 뚜껑에서 방울을 수집합니다. 테두리를 적시지 않고 샘플을 DNA 추출 컬럼(컬럼은 2mL 수집 튜브에 있음)으로 옮깁니다. 6,000× g 에서 1분 동안 원심분리기
      4. 깨끗한 2mL 수집 튜브에 컬럼을 넣은 후 플로우스루가 들어 있는 수집 튜브를 폐기합니다. 세 번째 DNA 추출 키트 완충액 500μL를 림을 적시지 않고 컬럼에 추가하고 6,000× g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
      5. 다시 말하지만, 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣은 후 플로우스루가 들어 있는 수집 튜브를 폐기합니다. 네 번째 DNA 추출 키트 완충액 500μL를 림을 적시지 않고 컬럼에 추가하고 6,000× g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
      6. 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 플로우스루 함유 수집 튜브를 폐기합니다. 20,000 × g 에서 3분 동안 원심분리기
      7. 컬럼을 깨끗한 1.7mL 미세 원심분리기 튜브에 넣고 플로우스루 함유 수집 튜브를 폐기합니다. 용리를 위해 20μL의 분자 등급 물을 컬럼 멤브레인 중앙에 추가합니다. 뚜껑을 닫고 실온에서 분자 등급 물로 5분 동안 샘플을 배양합니다.
      8. 20,000× g 에서 1분 동안 원심분리기 용리된 DNA를 단기 보관의 경우 4°C, 장기 보관의 경우 -20°C에서 보관합니다.
3. RNA 분해 및 세척
   참고: 재료 표 에 나열된 DNA 추출 키트의 핸드북은 이 DNA 클린업 프로토콜을 도출하는 데 사용되었습니다. dPCR 조건, 시약, 프라이머 및 프로브 설계에 따라 dPCR vg/dg 정량을 진행하기 전에 DNA 샘플에 RNA가 완전히 없는지 확인해야 할 수 있습니다. RNA 오염은 특정 dPCR 조건에서 다양한 정도의 부정확한 vg/dg 값을 초래할 수 있습니다.
   1. 0.2 mL PCR 튜브 또는 1.7 mL 미세 원심분리기 튜브에 추출된 DNA 샘플의 최대 20 μL와 DNase-free RNase의 1.5 μL를 각 DNA 샘플에 추가합니다. DNA/RNase 혼합물 부피가 21.5 μL 미만인 경우 최종 부피 21.5 μL에 분자 등급 물을 충분히 추가하고 튜브를 뒤집어 25배 혼합합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하고 튜브를 뒤집어 10 분마다 주기적으로 혼합합니다.
      참고: 튜브에 첨가되는 핵산의 총량은 175ng에서 700ng 사이여야 합니다. DNA 샘플에 이 범위를 벗어난 부피 또는 핵산 양이 포함되어 있거나 DNA 샘플이 다르게 분리된 경우 수정이 필요할 수 있습니다.
   2. 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 각 DNA/RNase 혼합물에 최종 부피 100 μL까지 충분한 분자 등급 물을 추가합니다.
      참고: 여기에 나열된 RNase는 타겟 DNA 또는 다운스트림 PCR 분석에 부정적인 영향을 주지 않고 오염된 RNA를 분해하기 때문에 권장됩니다.
   3. 게놈 DNA 청소에 대한 제조업체의 프로토콜을 따르십시오( 재료 표 참조).
      1. 첫 번째 DNA 추출 키트 완충액 10μL와 두 번째 DNA 추출 키트 완충액 250μL를 추가합니다. 10초 동안 펄스 소용돌이로 혼합합니다.
      2. 테두리를 적시지 않고 2mL 수집 튜브에 담긴 DNA 추출 컬럼으로 샘플을 옮깁니다. 6,000× g 에서 1분 동안 원심분리기
      3. 깨끗한 2mL 수집 튜브에 컬럼을 넣은 후 플로우스루가 들어 있는 수집 튜브를 폐기합니다. 두 번째 DNA 추출 키트 완충액 500μL를 림을 적시지 않고 컬럼에 추가합니다. 6,000× g 에서 1분 동안 원심분리기
      4. 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 넣고 플로우스루 함유 수집 튜브를 폐기합니다. 20,000 × g 에서 6분 동안 원심분리기
      5. 깨끗한 1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브에 컬럼을 넣고 플로우스루가 들어 있는 수집 튜브를 폐기합니다. 용출을 위해 컬럼 멤브레인 중앙에 분자 등급 물 20μL를 추가하고 뚜껑을 닫은 다음 분자 등급 물과 함께 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.
      6. 20,000 × g 에서 1분 동안 원심분리기 단기 보관의 경우 4 °C, 장기 보관의 경우 -20 °C에서 보관하십시오.
      7. 단일 엑손뿐만 아니라 여러 엑손에 걸쳐 있는 mRNA 영역을 증폭하는 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 종말점 PCR 또는 dPCR 또는 정량적 PCR(qPCR)로 RNase 분해 샘플에서 RNA 오염이 없는지 확인합니다.
         참고: mRNA 표적은 mRNA 오염이 존재하는 경우 올바르게 식별할 수 있도록 표적 조직/세포 유형에서 고도로 발현된 유전자여야 합니다. 여러 엑손에 걸쳐 있는 앰플리콘은 mRNA와 게놈 DNA의 오염으로 인한 띠를 구별합니다. mRNA 오염이 있는 경우 이를 검출할 수 있도록 항상 RNase가 아닌 분해된 DNA 샘플을 PCR 반응에 대한 양성 대조군으로 사용하십시오.
4. 디지털 PCR(dPCR)
   1. primer의 특이성 및 최적의 PCR 조건을 확인하기 위한 End-point PCR(선택 사항)
      1. 벡터 게놈에 대한 dPCR 프라이머 쌍 및 프로브를 설계하고 샘플의 이배체 게놈을 정량화하는 데 사용할 마우스 참조 유전자에 대한 dPCR 프라이머 쌍 및 프로브를 설계합니다.
         참고: 60 bp에서 150 bp 사이의 앰플리콘 크기를 목표로 하십시오. 마우스 참조 유전자는 이배체 게놈당 일정한 유전자 복제 수를 갖는 유전자여야 합니다. 여기에 나열된 계산을 위해 참조 유전자(Polr2a)는 이배체 게놈당 2개의 복사본을 가지고 있습니다.
      2. 10 μL 말점 PCR 반응의 경우 나중에 dPCR 반응에 사용할 시약과 최종 농도를 사용하여 PCR 혼합물을 준비합니다. DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 1x dPCR 마스터 믹스 1x dPCR 마스터 믹스, 각 전방 프라이머 0.8μM, 각 역방향 프라이머 0.8μM, 각 프로브 0.4μM 및 제한 효소 0.025U/μL의 최종 농도에 RNase 분해 템플릿 DNA 샘플(핵산 양 범위 56-223ng)을 추가합니다(제한 효소의 최종 농도는 사용된 제한 효소 및 브랜드에 따라 다름). 분자 등급의 물을 첨가하여 최종 부피 10μL에 도달합니다.
         참고: PCR 믹스에는 적어도 두 개의 프라이머 쌍과 두 개의 프로브가 있어야 합니다: 벡터 게놈을 검출하기 위한 프라이머 쌍 1개와 프로브 1개, 마우스 게놈을 검출하기 위한 프라이머 쌍 1개와 프로브 1개.
      3. PCR 열 순환 조건: 95°C에서 2분 동안 초기 열 활성화 단계, 95°C에서 25초 동안 변성 단계를 35-45회 주기하고 58-62°C에서 1분 동안 결합 어닐링/확장 단계를 수행합니다.
         참고: 최적의 어닐링 온도는 각 앰플리콘 및 프라이머 쌍에 대해 결정해야 합니다. 사이클의 수는 샘플의 템플릿 DNA의 양에 따라 조정할 수 있습니다.
      4. 겔 전기영동을 사용하여 아가로스 겔에서 PCR 산물을 시각화하여 표적 앰플리콘 띠 및 가능한 비특이적 증폭 띠의 존재를 확인합니다.
      5. 프라이머 쌍과 순환 조건이 타겟 염기서열의 특정 증폭을 초래하는지 확인한 후 다음 dPCR 단계로 진행합니다.
   2. dPCR 반응
      1. 40 μL dPCR 반응의 경우, DNA 중합효소 및 dNTP를 포함하는 1x dPCR 마스터 믹스의 최종 농도에 RNase 분해 템플릿 DNA 샘플(핵산 양 범위 50-330 ng)을 최대 4 μL, 각 전방 프라이머의 0.8 μM, 각 역방향 프라이머의 0.8 μM, 각 프로브의 0.4 μM, 및 0.025 U/μL의 제한효소(제한효소의 최종 농도는 사용된 제한효소 및 브랜드에 따라 다름). 분자 등급의 물을 추가하여 최종 부피가 40μL에 도달합니다.
      2. dPCR 열 순환 조건: 95°C에서 2분 동안 초기 열 활성화 단계, 95°C에서 25초 동안 변성 단계의 40-50 사이클, 1분 동안 58-62°C에서 결합 어닐링/확장 단계.
         참고: 최적의 어닐링 온도는 각 앰플리콘 및 프라이머 쌍에 대해 결정해야 합니다. 사이클의 수는 샘플에서 템플릿 DNA의 양에 따라 조정할 수 있습니다. 여기에 나열된 부피, 농도 및 조건은 재료 표에 나열된 dPCR 플레이트, 시약 및 장치에 최적화되어 있습니다. 이러한 조건은 반응의 정확도를 감소시킬 수 있는 잠재적인 dPCR 억제제의 효과를 감소시킵니다.
      3. dPCR 반응을 실행하고 벡터 게놈 및 마우스 참조 유전자에 대한 절대값을 얻은 후 방정식 (7-8)을 사용하여 샘플에서 vg/dg를 계산합니다.
         두 개의 유전자 사본/이배체 게놈이 있는 참조 유전자의 경우:
         이배체 게놈의 절대값(dg) = (7)
         VG / DG = (8)
      4. dPCR 반응의 1D 산점도를 확인하여 분석 및 정량화의 타당성을 확인합니다(그림 3A,C). 분석이 유효하려면 1D 산점도가 다음 기준을 모두 충족하는지 확인하십시오. 정확한 임계값 결정을 허용하기 위해 양수 파티션과 음수 파티션 사이의 명확한 분리; 그리고 양극과 음극 칸막이 사이에 물방울이 거의 없는 경우(비라고도 함), 이는 dPCR 정량화의 정확도를 감소시킬 수 있습니다.

토론

AAV 기반 치료법은 유전자 치료 벡터로서 AAV의 다양성으로 인해 단일 유전자 장애에 대한 큰 잠재력을 가지고 있으며, 이를 통해 다양한 질환의 다양한 전달 요구를 충족시키기 위해 AAV를 맞춤화할 수 있습니다 4,5,7,9. AAV는 일반적으로 잠재적 치료제의 안전성과 효능을 테스트하기 위해 전임상 마우스 모델에서 IV 주입을 통해 투여됩니다¹⁶. 상이한 주입된 AAV 투여량은 실험 결과에서 현저한 차이를 초래할 수 있으므로, 실험자가 생성된 생체 내 데이터의 타당성 및 견고성을 보장하기 위해 의도된 AAV 투여량을 일관되게 주입할 수 있는 것이 중요하다²⁸. IV 주사는 널리 사용되지만, 기술적으로 까다롭기 때문에 지속적으로 성공적인 주사를 보장하는 기술 수준을 개발하고 유지하기 위해 광범위한 교육과 지속적인 연습이 필요하다 16,17,18,19. AAV를 정확하게 주입하는 것 외에도, 주입된 AAV의 생체 분포 및 표적 조직 또는 세포에 대한 전달 효율을 평가하기 위해 분석을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다(^29,30).

이 프로토콜은 7-9주 된 진정되지 않은 마우스에서 AAV를 투여하기 위해 최적화된 IV 주입 프로토콜의 세부 사항을 철저히 설명함으로써 실험자가 IV 주입을 성공적이고 일관되게 쉽게 수행할 수 있도록 돕는 것을 목표로 합니다. 여기에 사용된 연령 범위에서 야생형 마우스보다 현저하게 작거나 큰 마우스는 정맥의 가시성이 감소하거나 이 방법에 사용된 억제제와의 비호환성으로 인해 더 큰 도전을 제시할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. tail IV 주사는 혈관 크기가³¹인 작은 때문에 생후 6주 미만의 마우스에서 시약을 정맥 투여하는 데 적합하지 않다는 것이 이전에 보고된 바 있습니다. 가능하기는 하지만, 체중이 22.0g 미만인 마우스를 성공적으로 주입하는 것은 어려울 수 있습니다. 비정형 크기의 마우스를 사용하는 조사자는 절차에 적응해야 할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 AAV 생체내 분포 및 transduction 효율성을 평가하는 데 사용할 수 있는 여러 분석법을 간략하게 설명합니다.

이 프로토콜을 따르는 동안 몇 가지 중요한 점을 염두에 두어야 합니다. 주입하는 동안 29G 바늘은 바늘이 정맥 내부에 있지 않은 경우 더 큰 저항을 제공합니다. 이는 실패한 주입 시도 동안 우발적인 용액의 혈관 주위 주입으로 손실되는 부피를 줄입니다. 인슐린 주사기는 일반 주사기보다 사체량이 작습니다. 여기에 나열된 것과 다른 주사기 및/또는 바늘을 사용하는 경우 더 큰 데드 스페이스 부피를 설명하기 위해 프로토콜 단계 1.1.3.3에서 추가 주입 부피를 준비해야 할 수 있습니다(예: 의도한 용량에 15μL 대신 30μL 추가).

AAV 투여량을 주사기로 흡입하는 동안 주사기 측면에 미세한 흡인으로 인한 기포가 형성되면 주사기를 주사기 위로 천천히 당겨 넣습니다. 이렇게 하면 대부분의 작은 기포가 제거됩니다. 주입할 의도된 부피에 최소 10-15μL의 AAV를 추가로 로드합니다. 이 추가 부피는 기포를 배출하거나 잠재적인 주입 시도 실패 중에 손실될 수 있는 부피를 설명하기 위한 것입니다. (예: 주입할 목표 부피가 150μL인 경우 주사기에 165μL를 로드합니다(주사기 스케일에서 160μL와 170μL 표시 사이의 중간). 바늘이 정맥 내부에 올바르게 배치되고 주사기의 부피가 성공적인 주입 시도 직전에 165μL인 경우 주사기에 15μL가 남을 때까지(10μL와 20μL 표시 사이의 중간) 시약을 전달하여 150μL(165μL - 150μL= 15μL)를 전달합니다. 베벨 루멘(베벨이 위쪽을 향함)을 주사기 스케일에 맞추면 주입 중에 전달된 부피를 추적할 수 있습니다.

일부 실험자는 발을 딛고 있는 쥐에 비해 정맥 중 하나가 직선이고 쉽게 접근할 수 있도록 쥐를 옆으로 눕히는 것을 선호할 수 있습니다. 그러나 옆으로 눕힌 마우스의 꼬리는 마우스 크기에 따라 다른 각도로 기울어지기 때문에 크기가 다른 마우스를 주입할 때 주입 각도 조정이 필요합니다. 이는 절차의 성공 일관성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 초기 연습 시도 중에 실험자는 선호하는 접근 방식을 결정하기 위해 두 가지 마우스 구속 방향을 모두 시도할 수 있습니다. 마우스를 발에 딛고 있으면 양쪽 꼬리 정맥에 빠르고 쉽게 접근할 수 있습니다. 이렇게 하면 주사 시도가 여러 번 실패한 경우 두 정맥에 대한 접근이 필요한 구속 시간을 줄일 수 있습니다.

측면 정맥을 꼬리 기저부에 가까운(마우스 몸에 더 가까운) 주입하는 경우(특히 체중이 >30g인 마우스의 경우) 꼬리 기저부의 정맥이 원위보다 약간 깊기 때문에 정맥과 평행한 곳에서 정맥에 대해 5°-10°로 주입 각도를 조정합니다.

여기에 나열된 RNase 분해 및 RNA 오염 검사 프로토콜은 20 μL에 총 175-700 ng의 핵산을 함유한 신선 냉동 간 조직에서 분리한 DNA 샘플에서 검증되었습니다. RNase 분해 프로토콜은 또한 RNase 분해 후 벡터 게놈과 마우스 게놈의 존재를 확인하기 위해 신선 냉동 간 조직과 FACS 분류 세포에서 분리한 DNA 샘플에 대해 테스트되었습니다. 결과는 타겟 앰플리콘의 종말점 PCR 증폭의 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 시각화되었습니다.

설명된 방법론을 따르면 IV 주입을 마스터하는 데 필요한 교육 및 연습 시간을 줄이고 주입 성공률을 높여 시약을 절약할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쉽게 사용할 수 없는 고급 장비나 설정 없이 간단하고 일반적으로 사용되는 도구를 사용합니다. 또한, 여기에 나열된 IV 주입 단계는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)와 같이 정맥 주사가 필요한 광범위한 주사제에 적용할 수 있으며, 주사제에 따라 주사제 준비 단계를 적절하게 수정하여 적용할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm syringe filter	Millipore	SLGVM33RS
0.3 mL insulin syringes with 29G needle	BD Biosciences	324702
1.7 mL microcentrifuge  tube	Crystalgen	23-2051
10 mL syringe	BD Biosciences	302995
100% EtOH	The Warner Graham Company	201096
10x phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	46-013-CM	Used to prepare 1x PBS for tissue fixation
15 mL conical tube	Corning	430766
15 mL conical tube holder	Multiple sources	N/A
190 proof ethyl alcohol	The Warner Graham Company	6810-01-113-7320	Used to prepare 70% ethanol
1x sterile PBS	Gibco	10010023
2 mL microcentrifuge tissue storage tubes	Eppendorf	022363344
4% paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	157-4
Adeno-associated virus (AAV)	Charles River	N/A	Single-stranded DNA (ssDNA) AAV was packaged to deliver Cre recombinase as the transgene driven by CMV promoter
Alcohol swab	BD Biosciences	326895
Bead lysis tube	Next Advance	GREENE5
BsuRI (HaeIII) restriction enzyme	Thermo Fisher Scientific	ER0151
Bullet blender	Next Advance	BBX24B
Ai14-derived mice from JAX 007914 strain (genetic background: C57BL/6J)	N/A	N/A	Mice containing Ai14 Cre-reporter allele were purchased from JAX (catalog number: 007914)
Disposable absorbent pads	Fisherbrand	1420662
Dissection forceps	Fine Science Tools (F.S.T)	11251-35
Dissection scissors	Fine Science Tools (F.S.T)	14085-08
DNA degradation reagent (DNAZap)	Invitrogen	AM9890
DNA-Extraction RNase A	Qiagen	19101	For RNA digestion during nucleic acid extraction
DNase-free RNase for DNA cleanup	F. Hoffmann-La Roche	11119915001	For RNA digestion after nucleic acid extraction
dPCR Probe PCR Kit	Qiagen	250102
dPCR software	Qiagen	N/A	QIAcuity Software Suite
Elevated platform	Multiple sources	N/A	An empty pipette tips box was used to elevate the mouse restrainer during tail warming up
Fluorescence microscope	Multiple sources	N/A	Model used here: Nikon Eclipse Ti
Fluorescence microscope software	Multiple sources	N/A	Software used here: NIS-Elements
Gauze	Covidien	9022
Heat block	Eppendorf	Thermomixer 5350
High-speed centrifuge	Eppendorf	22620689
Metal container	Vollrath	80125
Methylbutane	J.T. Baker	Q223-08
Molecular grade water	Quality Biological	351-029-131
Mouse tube restrainer	Braintree Scientific	TV-RED-150-STD
Myfuge mini centrifuge	Benchmark Scientific	C1012
Polymerase chain reaction thermal cycler	Bio-Rad Laboratories	1851148	Model: C1000 Touch
Precision wipes	Kimberly-Clark Professional	7552
Proteinase K	Qiagen	19131
QIAcuity dPCR Nanoplate 26k 24-well	Qiagen	250001
QIAcuity One dPCR system	Qiagen	911020
Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504	Used for DNA extraction from tissues
Qiagen QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304	Used for cleanup of genomic DNA, and the isolation of DNA from small volumes of blood prtocotol was used for DNA extraction from FACS-sorted cells
Rodent restrainer cone	Braintree Scientific	MDC-200
Scale	Ohaus	72212663
Styrofoam box	Multiple sources	N/A
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378-1kg
Surface cleaner and disinfectant	Peroxigard	29101
Timer	Multiple sources	N/A
Transfer forceps	Fine Science Tools (F.S.T)	91113-10
Vortex	Daigger & Company	22220A	Model: Daigger Vortex Genie 2