일차 해마 뉴런의 transfection 2일 후에 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징을 준비합니다. 라이브 셀 챔버 부착물 60x 주관식 및 렌즈 오일을 섭씨 37도로 예열하고 챔버를 5% CO2로 평형화합니다. 접안렌즈를 사용하여 cargo protein을 포함하는 채널에서 transfection된 뉴런을 식별합니다.
그런 다음 스캔을 클릭하여 뉴런을 이미지화하고 SCI-5 채널의 축삭 초기 세그먼트를 식별합니다. 시야를 32 x 128 픽셀의 직사각형 상자로 설정하고 축삭 초기 세그먼트 원위부에서 50-150 미크론의 축삭 영역을 이미지로 이동합니다. 화물 운송의 방향과 ROI의 방향을 기록한 다음 다른 이름으로 저장을 눌러 파일로 저장합니다.
상자의 점은 다음 이미지의 상단과 오른쪽에 나타납니다. 세포체에 가장 가까운 이미지 면과 축삭 말단에 가장 가까운 면을 기록하여 comagraph Polyline의 올바른 방향을 보장합니다. 561 레이저 출력을 1.40으로, 핀홀을 7.8로, 크기를 128픽셀 정사각형으로, 속도를 초당 32프레임으로 설정합니다.
게인을 조정하여 배경 신호에 의해 가려지지 않고 개별 화물 소포의 운송을 시각화할 수 있습니다. ROI 드롭다운 메뉴에서 draw rectangular ROI를 선택하고 전체 시야를 포함하도록 ROI를 그립니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 ROI S1을 자극으로 사용을 선택합니다. 그런 다음 ND setup 탭에서 acquire image를 클릭하여 사전 자극 참조 이미지를 수집합니다.
그런 다음 자극을 ROI S1로, 간격을 지연 없음으로, 지속 시간을 1.64초로, 루프를 7로 설정합니다. 그런 다음 이미지 획득을 클릭하여 포스트 자극 참조 이미지를 수집합니다. waiting, no acquisition, 2분을 선택하여 형광 화물이 표백된 ROI를 다시 채울 수 있는 복구 기간을 제공합니다.
획득 간격, 지연 없음, 지속 시간 5분, 루프, 8, 615를 선택합니다. ND 설정 탭에서 자극 설정 적용 버튼을 클릭한 다음 지금 실행을 클릭합니다. 또한 분석을 위해 두 개의 뉴런에서 수송 비디오를 수집합니다.
시야를 전체 영상으로 재설정한 다음 ROI 박스가 포함된 561 및 647 채널에서 전체 뉴런의 영상을 수집합니다. 단백질 발현의 사후 고정 확인을 위해 이미지를 촬영한 XY 좌표를 기록합니다. 화물 단백질 mAPL의 Synaptophysin을 발현하는 형질주입된 뉴런의 생세포 이미징을 이 프로토콜을 사용하여 수행했습니다.
Axon 초기 세그먼트에서 neuro fasin의 외부 도메인도 라벨링되었습니다. 화물 운송의 이미징은 관심 축삭 영역에서 수행되었습니다. 추가 이미징 후 면역형광 분석에서 타우 단백질과 mAPL 시냅토피신의 동시 발현이 확인되었습니다.
