96 well plate에서 내피 세포를 성장시킨 후 인큐베이터에서 제거하고 도립 현미경을 사용하여 밀도를 확인합니다. 접시를 싱크대에 튕겨 전체 미디어를 제거하고 종이 타월로 접시 상단을 닦아냅니다. HBSS HEPES 분석 완충액과 프로브네시드 용액을 50mL 멀티채널 피펫 용매 저장소에 추가합니다.
다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100마이크로리터의 분석 완충액을 추가하고 세포를 5분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 플레이트를 튕겨 분석 버퍼를 제거합니다. 다운로드 버퍼를 별도의 50 mL 멀티채널 피펫 용매 저장용기에 추가합니다.
다중 채널 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 염료 로딩 버퍼를 분석 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 45분 동안 접시를 배양합니다. 배양 후 형광 현미경으로 플레이트를 관찰하여 염료 흡수를 확인합니다.
플레이트를 튕겨 염료 용액을 제거합니다. 각 웰에 50마이크로리터의 HBSS HEPES 분석 완충액과 프로베네시드 용액을 넣어 세포를 두 번 세척합니다. 플레이트를 튕겨 분석 완충액을 제거합니다.
각 웰에 92마이크로리터의 HBSS HEPES 분석 완충액을 추가하고 다시 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 과도한 염료가 완전히 제거되었고 세포가 부착된 상태로 유지되는지 확인합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 2마이크로리터의 길항제 용액과 차량을 적절한 웰에 추가합니다. 플레이트 리더를 켠 후 온도를 섭씨 37도로 설정하고 플레이트를 15분 동안 배양합니다.
1열과 2열에서 배경 형광을 측정하여 웰당 5번의 스캔을 수행합니다. 플레이트 리더에서 플레이트를 배출한 다음 8-튜브 PCR 스트립에서 다중 채널 피펫을 사용하여 6마이크로리터의 작용제 용액을 컬럼 1과 2의 각 웰에 빠르게 추가합니다. 세포에서 칼슘 동원이 발생할 때 형광의 변화를 측정합니다.
각 웰을 20회 스캔합니다. 내피 세포를 사용한 칼슘 동원 분석은 길항제가 없는 양성 대조군 웰이 형광의 급격한 증가를 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 길항제 농도가 높은 웰은 작용제가 없는 음성 대조군 웰과 유사하게 형광 변화가 최소화된 것으로 나타났습니다.
