이 프로토콜을 사용하면 살아있는 동물의 상처 치유 동안 상피 세포를 시각화 할 수 있습니다. 이를 통해 우리는 세포가 자연스럽고 복잡한 환경에서 어떻게 행동하는지 볼 수 있습니다. 이 기술은 시약을 세포외 기질과 세포질에 도입하여 살아있는 동물의 상처 치유 동안 세포 확산 및 이동에 대한 이러한 시약의 효과를 연구합니다.
상피 상처 치유와 Clytia는 더 복잡한 동물에서의 치유와 매우 유사합니다. 따라서 우리는 이 시스템에서 상처 치유의 메커니즘과 그 기원에 대해 많은 것을 배울 수 있습니다. 이러한 절차를 시연하는 것은 엘리자베스 리 (Elizabeth Lee)와 연구 기술자 에밀리 와토 (Emily Watto)가 될 것입니다.
상처 부위 과정을 시작하려면 피펫 팁을 가위로 절단하여 직경이 약 0.5-0.7cm인 확대된 개구부를 만들어 수정된 이송 피펫을 준비합니다. 수정된 이송 피펫을 사용하여 확립된 폴립 콜로니에서 채취한 메두사를 메두사 X 우산이 위쪽을 향하도록 하여 함몰 슬라이드에 놓습니다. 인공 바닷물(ASW)이 동물을 덮을 만큼만 있는지 확인하십시오.
세포 내부와 세포 사이에 미세한 상처를 만들려면 동물 위에 덮개 슬립을 놓습니다. 커버 슬립은 mesoglea를 압축하고 압축 된 조직의 반동은 세포를 약간 떨어 뜨립니다. 생성 된 미세 상처를 관찰하기 위해 동물을 즉시 이미지화하십시오.
작은 상피 상처를 만들려면 앞에서 설명한 것처럼 수정된 전사 피펫을 사용하여 메두사 X 우산이 위를 향하도록 하여 메두사를 함몰 슬라이드에 놓습니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 메두사 표면을 부드럽게 긁습니다. 부드럽게 긁으면 기저막이 찢어질 수 있습니다.
이미징을 위해 덮개 슬립으로 동물을 덮으십시오. 커버 슬립을 놓는 것만으로도 긁히지 않아도 작은 상피 상처를 만들기에 충분할 때가 있습니다. 마이크로 피펫 필러와 유리 모세관을 사용하여 텍스트에 설명 된 단계에 따라 미세 주입 바늘을 준비하십시오.
빈 미세주입 바늘을 미세 매니퓰레이터에 부착된 미세주입 홀더에 넣고 개구부가 약 20 내지 40미크론이 되도록 바늘 끝을 자릅니다. 마이크로 인젝터의 유지 압력을 0으로 설정하고 배출 압력을 제곱인치당 약 20파운드로 설정합니다. 2초의 공기 펄스를 전달하도록 마이크로 인젝터를 설정합니다.
큰 상피 상처를 만들려면 앞에서 설명한 것처럼 메두사를 함몰 슬라이드에 놓습니다. 미세 매니퓰레이터를 사용하여 미세 주입 바늘 끝을 물 바로 위에 유지하도록 조정하고 팁을 물에 조심스럽게 담근 다음 메두사의 상피 표면에 가깝도록 집어넣습니다. 인젝터의 시작을 눌러 공기를 펄스합니다.
팁의 너비에 따라 같은 지점에서 펄스를 2-4회 반복합니다. 팁이 클수록 더 적은 펄스가 필요합니다. 큰 상처를 이미징하기 위해 부상당한 동물을 커버 슬립으로 덮으십시오.
x 우산에 초점을 맞춥니다. 육각형 셀은 깨끗해야합니다. 상처를 수동으로 식별하여 이미지화합니다.
이미지를 실시간으로 동영상으로 수집하는 프로그램이나 일정한 간격으로 일련의 이미지를 수집하는 프로그램을 시작합니다. 진행 상황을 모니터링하여 상처 부위가 시야를 벗어나지 않고 관심 세포에 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다. 염료와 약물을 주입하려면 텍스트에 설명 된 단계에 따라 미세 주입 바늘을 만드십시오.
긴 피펫 팁을 사용하여 메두사에 주입하기 위해 과도한 양의 염료 또는 약물로 미세 주입 바늘을 다시 채웁니다. 변형된 이송 피펫을 사용하여 서브 우산이 위를 향하도록 메두사를 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 주입 접시에 놓고 동물을 덮을 만큼만 ASW를 넣습니다. 접시를 해부 현미경의 무대에 놓습니다.
미세 주입 바늘 끝에 초점을 맞추고 메두사 근처의 물 속으로 전진시킵니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘이 구부러지고 부러질 때까지 접시에 바늘을 누르십시오. 약 10 - 20 미크론의 팁 개구부를 만듭니다.
마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 X 우산에 구멍을 뚫지 않고 서브 우산을 통해 바늘 끝을 메조글리아에 삽입합니다. 마이크로 인젝터에서 유지 압력을 0으로 설정하고 사출 압력을 제곱인치당 20파운드 이하로 설정합니다. 하나 또는 두 개의 사분면에 주입하여 각 사분면 면적의 약 1/4에 염료 또는 약물 반점을 채웁니다.
주입되는 염료 또는 약물에 따라 동물을 신선한 ASW 비커에 넣어 염료 또는 약물 확산 및 배양을 허용합니다. 이미징을 위해 수정된 이송 피펫을 사용하여 메두사를 함몰 슬라이드에 장착하고 X 우산이 위를 향하도록 동물을 배치합니다. 주입 된 시약의 효과를 테스트하기 위해이 단계에서 동물을 상처 입힐 수 있습니다.
세포 내부와 세포 사이의 미세 상처는 상처 봉합 동안 작은 라멜리포디아를 형성했습니다. 그 후 수축이 뒤따랐고 상처는 1분도 채 되지 않아 치유되었습니다. 작은 상피 상처는 또한 lamellipodia 형성 및 lamellipodia 접촉의 확장을 통해 치유되었습니다.
신속하고 점진적인 상처 봉합은 새로 형성된 상처 솔기를 따라 조직 수축에 선행했습니다. 시간 경과에 따른 전체 상처 면적의 백분율로 표현된 두 개의 작은 상처의 정규화된 치유율은 상처 봉합 역학에서 약간의 변동성을 나타냅니다. 14개의 상이한 상처로부터의 데이터를 사용하여 처리되지 않은 동물에서 평균 상처 치유 곡선을 확립하였다.
기저막 손상이있는 작은 상처에서 가장자리 세포가 손상된 부위 주위로 퍼지고 틈이 지갑 끈 수축으로 닫힙니다. 조직이 탈수되거나 너무 손상되어 복구할 수 없으면 세포 이동이 멈추거나 전체 세포 시트가 파열될 수 있습니다. 큰 상처는 여러 단계로 치유되었습니다.
가장자리에서의 수축, lamellipodia 형성 및 lamellipodia의 확장에 따른 가장자리의 평활화는 가장자리에서 집단 세포 이동과 여러 세포 계층에서 떨어져 있으며 가장자리는 큰 간격을 닫았습니다. 핵 및 막 염색은 시약을 ECM에 미세 주입하여 달성되었습니다. cytochalasin B의 미세 주입은 상처 후 lamellipodia 형성을 억제했습니다.
동물을 부드럽게 다루십시오. 시약을 주입 할 때 미세 주사 바늘의 끝이 mesoglea에 있고 동물을 완전히 통과하지 않았는지 확인하십시오. 현재, 형질전환 동물은 형광 태그 단백질로 만들어지고 있으며, 형광 및 미분 간섭 조영 현미경의 조합은 상피 상처 치유에서 세포 사건의 훨씬 더 명확한 이미지를 제공할 것이다.
