이 방법은 장 내 신경 과학 및 위장 생리학의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 이러한, 발광 자극에 장노 로마핀 세포 흥분성 및 반응의 메커니즘은 무엇입니까, 그리고 위장 호르몬 방출의 메커니즘은 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 우리가 전기 생리학과 같은 단세포 기술을 사용하여 상세한 장옥로마핀 세포를 연구 할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 공동 첫 번째 저자 케이틀린 너트슨과 피터 스트레지, 이러한 기술을 개발 뛰어난 기술자가 될 것입니다.
이 절차를 시작하려면, 추출 된 장 세그먼트의 루멘에 얼음 차가운 PBS로 채워진 6 밀리리터 주사기 바늘을 놓습니다. 미편 집게를 사용하고, 주사기 바늘 주위의 내장을 클램프하고 밀봉하고, 루멘을 통해 PBS의 6밀리리터를 부드럽게 플러시하여 배설물을 씻어냅니다. 다음으로, 루멘을 통해 미세 절 집게를 부드럽게 짜고, 장 벽을 꼬집고, 집게 의 끝에 있는 조직 근위를 철회하여 장 조직을 반전시킵니다.
세그먼트가 외부를 향하고 있는 루멘과 함께 내부 아웃 될 때까지이 과정을 반복합니다. 미세 절 부 가위를 사용하여 조직 세그먼트를 1 센티미터 조각으로 자른다. 그런 다음 조직 세그먼트를 멸균 PBS 의 5 밀리리터로 채워진 50 밀리리터 비커로 옮는다.
그 후, 액화 된 일관성에 조직 조각을 다진. 다진 조직과 15 밀리리터의 얼음 차가운 PBS를 깨끗한 50 밀리리터 튜브로 옮춥시다. 전송 파이펫으로 두 번 트리튜트합니다.
조직이 정착할 때까지 기다립니다. 그 후, PBS 상체의 15 밀리리터를 제거하고 신선한 PBS로 대체. PBS가 명확해질 때까지 이 프로세스를 세 번 반복합니다.
첫 번째 소화를 위해 수조에서 미리 따뜻해지지 않고 10밀리리터를 함유한 50밀리리터 튜브 중 하나를 검색합니다. 다음으로, 다진 장 조각으로 튜브에 PBS 콜라게나아제 용액 250마이크로리터를 추가합니다. 마지막으로, 다진 장 조직 조각은 소화 매체및 PBS 콜라게나아제 용액에 첨가되었다.
그런 다음 샘플을 섭씨 37도에서 5분간 수조에 보관하십시오. 10 밀리리터 세로지컬 파이펫으로 조직을 한 번 천천히 적시고 조직 조각이 정착하게 하십시오. 전사 파이펫을 사용하여 상체의 10 밀리리터를 제거합니다.
두 번째 소화를 위해, 조직에 PBS 콜라게나아제 용액의 250 마이크로리터를 추가하고 섭씨 37도에서 수조에 놓습니다. 그 후, 천천히 10 밀리리터 세로지오티 파이펫으로 한 번 용액을 적시. 그런 다음 상체의 10 밀리리터를 제거합니다.
세 번째 소화를 위해 튜브에 PBS 콜라게나제 용액 250마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도의 수조에 10분간 놓습니다. 그런 다음 소화1과 2보다 더 높은 강도로 분당 2~3회 튜브를 흔들어 줍니다.
그 후, 천천히 10 밀리리터 세로지컬 파이펫으로 조직을 위아래로 피펫하고 조직 조각이 짧은 시간 동안 정착 할 수 있도록합니다. 새로운 15 밀리리터 튜브로 상수의 10 밀리리터를 전송합니다. 따뜻하게 데운 EC 셀 완전 배양 배지 2밀리리터를 넣고 한 번 반전하여 혼합합니다.
다음으로 실온에서 5분간 100g의 샘플을 회전시합니다. 5 분 후, 상체를 제거하고 따뜻하게 된 EC 셀 전체 배양 배지의 2.5 밀리리터에서 나머지 펠릿을 다시 중단하십시오. 네 번째 소화의 경우 소화 절차를 반복하지만, 결장용 배양 시간을 15분 증가시키고, 제주는 10분동안 유지한다.
세포를 배양하기 위해, 전달 파이펫을 사용하여 소화 3및 4에서 수집된 세포 현탁액을 새로운 15 밀리리터 튜브로 결합합니다. 세포의 10 마이크로 리터 알리쿼트를 제거하고 혈종계로 계산합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 나머지 셀 서스펜션을 100g에서 회전시하십시오.
5분 후, 상체를 제거하고 밀리리터당 100만 개의 세포밀도로 5밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 EC 셀 완전 배양 배지를 추가합니다. 이송 파이펫을 사용하여 조직을 다시 중단합니다. 이어서, 인큐베이터에서 코팅된 유리 바닥 배양 요리를 제거합니다.
P1000 파이펫을 사용하여 각 배양 접시의 여분의 세포 매트릭스를 최종 셀 서스펜션의 250 마이크로리터로 교체하십시오. 전체 셀 기가씰을 얻으려면 전극을 목욕 용액으로 낮추어 보입니다. 마이크로 조작기로 전극 끝을 셀에서 직접 수평으로 기동합니다.
그런 다음 주사기에서 공기의 0.2 밀리리터를 추방. 전극을 X 축을 따라 수평으로 부드럽게 이동하여 셀을 만지십시오. 보조개가 EC 셀에 나타나고 씰 테스트에서 막 저항이 증가하는 것을 지켜보십시오.
주사기에 0.1 ~ 0.2 밀리리터의 흡입기를 적용하고 100 메가 옴이 달성 될 때까지 플런저를 안정적으로 유지하십시오. 그런 다음 플런저에서 그립을 놓습니다. 셀이 기가씰을 기다립니다.
그런 다음 주사기를 부드럽게 분리합니다. 전셀 전압 게이트 나트륨 전류를 기록하려면 주사기에 흡입을 빠르게 탭하십시오. 주사기를 부드럽게 분리하기 전에 전체 셀 액세스가 이루어질 때까지 반복합니다.
다음으로, 전체 셀 정전 용량 보정을 켜고 정전 용량 및 계열 저항을 조정합니다. 시리즈 저항 보정을 켭니다. 지연이 60 마이크로초로 설정되면 시리즈 저항 보정을 조정하고 씰 테스트를 종료합니다.
전셀 전압 게이트 나트륨 전류의 평균 5 개의 실행을 기록합니다. 전압 게이트 나트륨 전류의 두 매개 변수: 창 전류의 전압 및 피크 나트륨 전류 밀도의 두 매개 변수를 빠르게 주의하십시오. 유도 된 작업 잠재력을 기록하려면 전압 클램프에서 전류 클램프로 모드를 전환합니다.
에피소드 전류 클램프 프로토콜을 로드합니다. 여기서 유지 전류를 0 picoamp로 조정하고 외부 명령을 켭니다. 유도된 작업 잠재력을 기록합니다.
작업 잠재력을 발사하기 위해 주입된 전류의 최소 량을 기록합니다. 자발적인 작업 잠재력을 기록하려면 외부 명령을 끕니다. 간격이 없는 전류 클램프 프로토콜을 로드합니다.
실행 잠재력을 발사하지 않은 유도 프로토콜의 마지막 스윕에 주입된 전류의 양으로 유지 전류를 변경합니다. 그런 다음 외부 명령을 켭니다. 예측된 보유 전류가 실행 잠재력을 발사하기 위해 멤브레인 잠재력을 임계값 이하로 가져온다는 것을 다시 확인합니다.
필요한 경우 유지 전류를 조정하고 자발적활동을 기록합니다. 전기 생리학에 최적화 된 배양은 밝은 CFP 신호와 단일 세포와 작은 덩어리로 구성되었다. 배양 조건이 최적화되지 않았을 때 상피 세포 배양은 EC 세포에서 큰 덩어리, 부동 세포 이물질, 손상된 막 및 약한 CFP 신호로 구성되었습니다.
EC 전체 세포는 결장 배양에서 시도의 30 플러스 또는 마이너스 7 %에서 수득되었다, 41 플러스 또는 마이너스 3% 제주문화배양에서 시도의. 전세포 전세포학에 의해, 나트륨 전류는 제주눔에서 TPH-1 CPF 양성 세포의 81.3 플러스 또는 마이너스 4.0%에서 기록되었으며, 64.1 플러스 또는 마이너스 9.2%의 결장으로부터 기록되었다. 제주눔 배양으로부터 59개의 EC 세포 중, 현재 클램프 모드에서 19개의 EC 세포가 자발적인 AP를 발사했으며, 29개의 EC 세포는 현재 클램프 모드에서 단계 프로토콜에 의해 유도될 때만 AP를 발사했으며, 11개의 EC 세포는 자발적으로 또는 단계 프로토콜에 의해 AP를 발사하지 않았다.
이 절차를 시도하는 동안, 1 차상 상피 배양에 대한 최적의 소화 프로토콜이 사용 사이에 변수일 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다, 그래서 단일 세포를 얻기 위하여 동요의 최적 양을 결정하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 단일 세포 PCR 및 형광과 같은 다른 방법은 엔테로크로마핀 세포가 표현하는 것과 자극이 세포 간 신호에 결합되는 방법과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다. 이 개발 후, 이 기술은 장 내 생리학의 연구를 위한 길을 열어 내고, 어떻게 장학로마핀 세포가 작동하는지 그리고 마우스에 있는 위장 운동성 및 분비를 어떻게 조절하는지 탐구하기 위하여.
