우리의 프로토콜은 냄새 수용체 패널로 휘발성 냄새의 검출 및 차별을 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 악취 수용체 기반 바이오 센서를 개발할 가능성을 열어줍니다. 이 기술은 증기 상에서 악취 분자에 악취 수용체 활성화의 실시간 체외 모니터링을 할 수 있습니다.
그것은 체외와 생체 내 접근 사이의 간격을 채웁니다. 이 방법은 점막 대사 효소의 역할을 포함하여 악취 지각으로 이끌어 내는 사건의 운동학을 이해하는 데 이용될 수 있습니다. 시작하려면 원고에 따라 M10 및 M10 PSF를 준비하십시오.
세포는 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 M10 PSF의 10밀리리터로 배양됩니다. 상 대비 현미경으로 배양 접시를 관찰한다. 100%의 합류에 도달하면 세포를 미디어를 심고 PBS의 10 밀리리터로 부드럽게 세포를 세척하여 세포를 더 낮은 농도로 분할합니다.
그런 다음 PBS를 흡인하고 트립신-EDTA의 3 밀리리터를 추가합니다. 세포가 접시에서 해리 될 때까지 약 1 분 동안 반응하게하십시오. 5 밀리리터의 M10을 추가하여 트립신을 비활성화하고 파이펫을 위아래로 사용하여 접시에 부착 된 세포를 분리합니다.
접시에서 15 밀리리터 튜브로 셀 서스펜션 8밀리리터를 옮기고 튜브를 200회 G에서 5분간 원심분리합니다. 수퍼네티드를 흡인시키고 M10 PSF의 5밀리리터에서 세포를 재보페팅하여 세포 질량을 분해하도록 배관합니다. 튜브에 거품을 만들지 마십시오.
세포의 20%의 합류를 얻으려면 새로운 1, 000mm 세포 배양 접시에 M10 PSF의 9밀리리터를 추가하고, 재중단된 세포 용액의 1밀리리터를 전달한다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 20%의 합류로 자리한 이 요리는 48시간 만에 100%에 도달할 것입니다.
접시를 위상 대비 현미경 아래에 놓아 관찰합니다. 100% 세포 합류 배양 접시의 1/10을 가져 가라. 미디어를 흡인하고 PBS의 10 밀리리터로 부드럽게 세포를 씻으십시오.
그런 다음 트립신-EDTA 및 M10, 원심분리기로 세포를 치료하고 M10 PSF로 이전에 수행된 대로 다시 치료합니다. 한 개의 96웰 플레이트를 실현하려면, 5밀리리터의 재부유셀5밀리리터에서 5.5 밀리리터의 신선한 M10 PSF에 500 마이크로리터를 추가합니다.
파이펫 50 마이크로리터는 멀티채널 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 희석된 부유 세포의 마이크로리터를 삽입한다. 하룻밤 사이에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 먼저, 위상 대비 현미경으로 하룻밤 사이에 배양된 96웰 플레이트를 배치하고, 세포 합류를 관찰하고, 원고에 따라 전체 플레이트에 공통되는 플라스미드를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에서 첫 번째 경피 혼합물을 준비하여 30%와 50% 사이인지 확인한다.
Rho-pCi는 빈 벡터 음성 제어이며, Olfr1377은 시험된 악취 아세토페논에 반응하는 것으로 알려진 양성 대조군이다. 대조군 플라스미드 중 하나를 포함하는 두 개의 투명 혼합물로 믹스를 분할합니다. MEM 500 마이크로리터와 리포펙타민 2000 시약의 20 마이크로리터를 포함하는 두 번째 형질 혼합물을 준비합니다.
두 번째 믹스의 절반을 각 저장소에 잘 넣고 위아래로 파이프를 사용하여 부드럽게 섞습니다. 실내 온도에서 15 분 동안 튜브를 배양하십시오. 96웰 플레이트 1개에 M10 5밀리리터를 추가합니다.
각 저수지에 2.5 밀리리터를 넣고 부드럽게 섞습니다. 이전에 도금된 96웰 플레이트의 M10 PSF를 최종 경질 매체의 50마이크로리터로 교체한다. 하룻밤 사이에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다.
그런 다음 광미계의 문을 열고 진공 펌프에 연결된 튜브를 삽입합니다. 밤새 조명계의 챔버를 진공 청소기로 청소하십시오. 형질 전환 후, 위상 대비 현미경으로 96웰 플레이트를 관찰하여 60%에서 100%사이의 세포 합류를 보장하기 위해 HEPES의 10밀리머와 D-포도당의 5밀리머를 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액의 자극 용액을 준비한다.
96웰 플레이트에서 경피 배지를 제거하고 각 웰에 신선한 자극 용액 50 마이크로리터를 추가하여 세포를 세척합니다. GloSensor cAMP 시약 용액을 희석하기 위해 자극 용액의 파이펫 2.75 밀리리터를 5밀리리터 튜브에 넣고 cAMP 시약 용액의 75마이크로리터를 추가합니다. 우물에서 자극 용액을 제거하고 각 웰에 희석 된 cAMP 시약 용액 25 마이크로 리터를 추가합니다.
어둡고 냄새가 없는 환경에서 실온에서 96웰 플레이트를 2시간 동안 배양합니다. 첫째, 미네랄 오일 의 10 밀리리터에 1 %로 냄새아 세트 토페논을 희석하고 튜브를 캡. cAMP 시약 인큐베이션 시간이 끝나기 전에 새로운 96웰 플레이트에 각 음취용액25마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 이 냄새상 판을 광미계 챔버에 5분간 배치하여 휘발성 악취 분자로 챔버를 상형화합니다. 90초 플레이트 측정 20사이클 동안 0초의 지연으로 발광을 기록하도록 광도계를 설정하고 사이클 사이에 0.7초 간격을 두릅니다. 접시를 읽기 직전에 챔버에서 냄새 판을 제거하십시오.
감염된 세포를 포함하는 96웰 플레이트에서, 우물 사이의 공간에 25 마이크로리터의 오취제를 추가하고 신속하게 챔버에 다시 플레이트를 넣습니다. 30분 이내에 20사이클 동안 모든 우물의 발광 측정을 시작합니다. 발광 측정 후, 적어도 2 시간 동안 광범위하게 독서 챔버에서 냄새를 진공 청소기로 진공 청소기 내부의 나머지 악취를 제거합니다.
냄새 휘발성의 교차 오염을 피하기 위해 다음 냄새를 배양하기 전에 5 분 동안 압축 공기를 보내 신선한 공기로 대체하십시오. 데이터 분석을 시작하려면 광미계 소프트웨어에서 데이터를 내보냅니다. 각 녹화 시간에 대해 동일한 OR의 복제를 평균합니다.
최종 컨트롤에 정규화된 OR 응답을 계산하려면 빈 벡터 평균 값을 각 레코딩 시간에 OR 평균 값으로 나눕니다. 각 기록 시간 응답에 0초로 평균 OR 응답을 나누어 기초 활동에 대한 각 OR 응답을 정규화합니다. 각 OR의 곡선에 대한 단일 OR 응답 값을 얻으려면 곡선 아래 영역을 얻기 위해 각 또는 에 대한 각 기록 시간의 모든 발광 값을 합산합니다.
본 실험에서, 증기 냄새 자극시 마우스 ORs의 실시간 활성화는 20회 이상의 측정 주기를 모니터링하였다. 빈 벡터 제어는 시험된 ORs의 악취 유발 활동이 특정임을 보장하기 위해 사용되었다. 각 웰의 데이터는 먼저 각 주기에 대한 빈 벡터 제어 평균 값으로 정규화되었습니다.
그런 다음 다른 ORs의 응답을 비교하기 위해 이 분석에서 데이터가 OR 수준의 기초 활동 수준으로 정규화되었습니다. 각 OR에 대한 단일 활성화 값은 모든 측정 주기의 배출 값을 합산하여 각 또는 곡선 아래 영역을 계산하여 계산되었습니다. 또한, 복용량 의존 응답 증가 냄새 복용량을 사용 하 여 측정될 수 있다.
5개의 농도에서 아세토페논 자극에 대한 Olfr1377의 반응이 기록되었다. 만 세 높은 농도 Olfr1377을 활성화 할 수 있었다. 순수한 화합물 자극은 세포 독성으로 인해 시간이 지남에 따라 OR 반응을 감소시키는 경향을 나타낸다.
단계 동안, 당신은 우물 사이에 희석 된 냄새제를 추가하고, 신속하게 접시의 녹음을 시작할 준비를해야합니다. 악취 첨가와 모니터링 사이의 시간을 최소화하고 두 실험 사이의 일정해야 합니다. atria 세포는 생체 내재 물질이므로 적절한 진료소에서 세포를 처분하도록 상기시켜줍니다.
