이 프로토콜은 견고하고 신뢰할 수 있고 효율적이며 경제적인 것으로 입증되는 단백질-핵산 상호 작용 연구를 위한 비오틴 라벨 플랫폼을 제공합니다. 바이오틴 표지 핵산의 동일한 배치는 실험의 재현성을 유지하면서 오랜 기간 동안 사용될 수 있다. 마지막으로, 여기에 설명된 모든 비오틴 라벨 된 에세이는 하루 이내에 수행 할 수 있으며 특수 장비가 필요하지 않습니다.
절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 대학원생인 리나 유(Lina Yu)가 될 것입니다. MEIOB 및 MOV10 구조를 준비하고 적절한 박테리아로 변환합니다. MEIOB를 추출하기 위해 원심 분리를 통해 세포를 펠렛하고 얼음 차가운 덜벡코의 인산염 완충식식물 또는 DPBS 버퍼의 20 밀리리터에서 다시 중단합니다.
얼음에 세균 현탁액을 초음파 처리합니다. 그런 다음 12, 000배, 섭씨 4도에서 15분간 리자테를 원심분리하고 상복부를 신선한 튜브로 옮긴다. 미리 씻는 글루타티온-세파로즈 구슬을 2시간 동안 섭씨 4도에 배양합니다.
원심 분리구는 750배, 섭씨 4도에서 1분간 구슬을 펠릿으로 처리합니다. 얼음차가운 PBS 10밀리리터로 구슬을 8번 헹구는 다. 그런 다음 용출 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 구슬을 섭씨 4도에서 10분 동안 배양하고 원심분리를 통해 구슬을 엘테합니다.
용출을 여섯 번 반복하고 여섯 분획을 함께 풀. 동경의 단백질을 원심 필터로 옮기고, 100~200마이크로리터의 최종 부피를 위해 7, 500배 g에서 원심분리에 의해 농축한다. MOV10을 추출하기 위해, HEK293T 세포에서 단백질을 발현하고 원고 방향에 따라 세포를 펠릿한다.
완전한 EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일로 3 밀리리터의 셀 리시스 버퍼에서 펠릿을 다시 중단하고 얼음에서 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음, 섭씨 4도에서 lysate원심분리. K150 버퍼로 두 번 세척하여 안티 플래그 자기 구슬을 준비합니다.
세척 후, 얼음 차가운 K150 버퍼의 1 밀리리터에 구슬을 다시 중단하고 부드러운 회전과 섭씨 4도에서 2 분 동안 인큐베이션. 자석에 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 구슬을 셀 용해에 넣고 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다.
원고 방향에 따라 K150 버퍼로 구슬을 세척하고 플래그 용출 버퍼300 마이크로리터로 구슬을 재차판으로 재차질한다. 구슬을 자석 위에 놓고 MOV10 단백질로 상퍼를 수집하고 단백질 농도를 결정합니다. RNA 올리고뉴클레오티드를 각 올리고를 20 마이크로몰라로 희석하고 원고 방향에 따라 RNA 이중을 형성하도록 어닐링하여 RNA 올리고뉴클레오티드를 준비한다.
MEIOB 전기 전광 이동성 이동 분석또는 EMSA의 경우 원고 방향에 따라 시약을 혼합합니다. 20 마이크로리터의 최종 반응 부피에 물을 추가합니다. 실온에서 30분 동안 반응을 배양한 다음 5배 스톱 버퍼를 추가합니다.
MOV10 헬리케이스 활동 분석의 경우, 원고 방향에 따라 시약을 혼합하고 20 마이크로리터의 최종 반응 부피를 위해 물을 추가한다. 반응을 섭씨 37도에서 10분, 30분, 60분 동안 배양한 다음 5배 스톱 버퍼를 추가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 20% 네이티브 폴리아크릴아미드 젤을 준비하고 각 시료의 20~25마이크로리터를 각 음으로 적재한다.
브로모페놀 블루 마커가 젤의 하단 분기로 이동 될 때까지 얼음 욕조에 100 볼트에서 젤을 실행합니다. 아크릴아미드는 유해하고 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비로 처리하는 것이 중요합니다.
젤 플레이트를 분해하고 적재 우물과 사용하지 않은 차선을 제거하여 젤을 다듬습니다. 젤을 0.5배 TBE 버퍼에 놓습니다. 필터 용지 와 나일론 멤브레인을 젤 크기로 자르고 종이와 멤브레인을 미리 적시고, 전이를 위해 스택을 조립합니다.
90 밀리머퍼에서 20분 동안 반건조 전기전광 장치에서 젤에서 멤브레인으로 샘플을 전송합니다. 그런 다음 45~60초 동안 제곱된 센티미터당 120 밀리줄로 멤브레인을 조사하여 샘플을 교차연결합니다. 화학 발광 검출의 경우, 멤브레인에 버퍼를 차단20 밀리리터를 추가하고 부드럽게 흔들면서 15~30분 동안 배양하는 것으로 시작합니다.
차단 버퍼를 조심스럽게 제거하고 컨쥬게이트/차단 버퍼로 교체합니다. 멤브레인을 15분 동안 다시 배양합니다. 세척당 5분간 흔들면서 멤브레인을 네 번 씻으시다.
그런 다음, 30 밀리리터의 기질 평형 버퍼를 멤브레인에 추가하고 20~25rpm에서 흔들면서 5분간 배양한다. 기판 작업 용액으로 멤브레인의 전체 표면을 덮고 5 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후 화학 발광 이미징 시스템에서 1 ~ 3 초 동안 멤브레인을 스캔합니다.
MEIOB 단백질 A, C 및 E의 정제는 쿠마시 블루 염색 및 서부 얼룩 분석으로 확인할 수 있습니다. 적색 화살표는 정제 된 MEIOB 단백질의 위치를 나타냅니다. MEIOB 및 단일 좌초 DNA의 상호 작용은 EMSA를 사용하여 시각화될 수 있습니다.
농도 의존형 결합 및 분열이 관찰됩니다. 예상대로, 돌연변이 MEIOB-E 및 MEIOB-C는 그렇지 않은 동안 야생 형 MEIOB-A만이 DNA와 상호 작용합니다. MEIOB 및 단일 좌초 RNA의 상호 작용도 관찰될 수 있다.
야생형 MEIOB는 단일 좌초 RNA에 대한 농도 의존형 결합 및 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. 그러나, 정량적 비교는 MEIOB가 RNA 보다는 더 높은 효율로 DNA를 묶는다는 것을 보여줍니다. MOV10의 정제는 쿠마시 블루 스테인링으로 확인되었고, 단백질의 헬리케이스 활성은 5프라임 오버행을 가진 RNA 복층에서 측정되었다.
반응 시간이 증가함에 따라 MOV10은 이중 좌초 RNA를 점진적으로 풀어나아요. 분석 비용을 줄이기 위해, 화학 발광 검출은 검출 키트 시약의 2 배 희석 또는 자체 제작 시약으로 수행 될 수있다. 여기서 설명된 프로토콜은 EMSA와 같은 체외 생화학 적 분석및 비오틴이 일반적으로 사용되지 않은 효소 반응에 대한 기판으로 비오틴 표지 핵산을 성공적으로 사용했습니다.
