채널로독신 지원 회로 매핑은 장거리 신경 프로젝션의 기능적 매핑을 위한 정밀 기술입니다. 여기에서, 우리는 청각 두뇌 줄기에 있는 회로를 조사하기 위하여 이 접근을 사용하는 방법을 보여줍니다. 뇌 슬라이스에서 여러 소스의 축축이 혼합되어 전기 자극을 사용하여 개별 입력을 분리하기가 어렵습니다.
CRACM을 사용하면 이러한 제한을 극복할 수 있습니다. lambda를 찾고 지속적으로 스테레오탁스 좌표 시스템을 정의하는 것은 절차의 지속 시간을 짧게 유지하는 것처럼 어렵습니다. 모든 단계를 신중하게 매핑하면 성공률이 높아집니다.
먼저 수술 부위를 70%에탄올로 분사하여 살균 할 수 있도록 수건 커튼을 배치하여 수술 부위를 덮습니다. 케이지 침구를 제거하여 복구 케이지에서 질식의 위험을 제한합니다. 다음으로, 케이지 아래에 난방 패드를 넣고 음식과 수원을 제공합니다.
다음으로, 동물을 스테레오테틱 프레임으로 옮기고 마취를 계속합니다. 직장 온도 프로브를 삽입하고 동종 온도 컨트롤러를 켭타코전환합니다. 그런 다음 안과 연고를 적용하여 눈이 건조되는 것을 방지하십시오.
선제적 진통제를 투여합니다. 마지막으로, 전기 클리퍼와 두피를 면도. 포비도네 요오드3개와 70%에탄올로 두피를 소독합니다.
중간선을 따라 두피에 절개를 하고, 귀사이를 시작하고 눈에 장밋빛을 계속시켜 람다와 브레그마 봉합사를 노출시켜 수술을 시작합니다. 피부에 옆으로 밀어 내고 필요한 경우 노출된 뼈에서 골라기질을 제거합니다. 다음으로, 램다 봉합사를 외과 마커로 표시하고, 나노 인젝터의 끝을 배치하여 람다만 만지고 마이크로 조작기 좌표를 0으로 설정합니다.
나노 인젝터 팁과 미세 조작기를 사용하여 람다와 브레그마 봉합사 사이의 표고 차이를 측정합니다. 팔레트 바 높이를 조정하여 람다와 브레그마를 플러스 또는 마이너스 100 마이크로미터 높이 차이로 가져옵니다. 나노 인젝터 팁 및 미세 조작기 좌표 시스템을 사용하여 사출 부위를 매핑하고 수술 마커로 사이트를 표시합니다.
그런 다음 0.5밀리미터 드릴 버가 있는 마이크로모터 드릴을 사용하여 주사 부위에 두개골 절제술을 수행합니다. 표적 핵에서 뉴런의 광범위한 침투를 보장하기 위해 나노 인젝터를 사용하여 조직의 다양한 깊이에서 주사를 만들고 열등한 콜리큘러스와 같은 더 큰 뇌 영역의 경우 다른 X 및 Y 좌표에서 두 개 이상의 침투를 통해 주사를 만듭니다. 열등한 콜리큘러스를 주입하려면 2, 250 마이크로미터 와 1, 750 마이크로미터 깊이 사이의 Z 축을 따라 250 마이크로미터의 간격으로 20 나노리터의 바이러스를 증착하십시오.
등쪽 달팽이관 핵에 주사를 대 한, 예금 20 나노 리터의 깊이4, 750 마이크로 미터 와 4, 550 마이크로 미터 각각. 각 Z 좌표에 주입 한 후, 바이러스가 주입 부위에서 확산 될 수있는 시간을 허용하기 위해 다음 Z 좌표로 인젝터를 이동하기 전에 2 ~ 3 분 기다린 후, 나노 인젝터가 재배치 될 때 바이러스가 주사 기관을 빨아 질 확률을 감소. 그런 다음 마지막 주사 후 뇌에서 나노 인젝터를 철회하기 전에 3 ~5 분 정도 기다립니다.
나노 인젝터가 침투와 동물 사이의 뇌에서 제거되면 팁이 막히지 않은지 확인하기 위해 팁에서 소량의 바이러스를 배출합니다. 주사 후 멸균 PBS를 사용하여 두피의 절단 된 가장자리를 적신 다음 피부를 미드 라인쪽으로 부드럽게 움직입니다. 6-0 나일론 봉합사를 사용하여 간단한 중단 봉합사로 상처를 닫습니다.
그런 다음 상처에 2 %리도카인 젤리의 1 밀리리터에 0.5를 적용하십시오. 이어 바 및 온도 프로브를 제거하고 이소플루란을 돌리고 팔레트 바에서 동물을 제거하고 복구 케이지로 옮습니다. 마지막으로 복구를 면밀히 모니터링합니다.
동물이 완전히 깨어 나고, 움직이고, 고통이나 고통의 흔적을 보이지 않고, 케이지로 다시 옮기고 케이지를 비바리움으로 되돌리십시오. 표준 패치 클램프 메서드를 사용하여 레코딩을 만듭니다. 먼저 고정 된 단계 직립 현미경 의 밑에 기록 챔버에 슬라이스를 배치하고 분당 2 밀리리터에서 인공 뇌척수액으로 지속적으로 교감하십시오.
다음으로, 적절한 패치 클램프 증폭기사용으로 시각적 제어 하에 뉴런을 패치한다. 마지막으로, 도매 녹음 중에 시판되는 LED를 통해 580나노미터 광의 짧은 펄스로 470나노미터 광 또는 ChrimsonR의 짧은 펄스를 제공함으로써 크로노를 활성화합니다. 결과는 ChrimsonR 주입이 세포와 섬유에서 보이는 tdTomato 형광을 가진 DCN에 있는 강한 발현으로 이끌어 낸다는 것을 표시했습니다.
반대로 ICC에서는, tdTomato로 강하게 표지된 섬유는 청각 두뇌 줄기 핵에 주입될 때 ChrimsonR-tdTomato 구조물의 장거리 인신 매매 능력을 보여주는 3 주 후에 명확하게 보였습니다. ChrimsonR의 광학 활성화는 IC VIP 뉴런에서 EPSP를 유도하여, 실험 파라미터가 청색광 대신 적색광사용을 요구할 때 ChrimsonR이 장거리 CRACM 실험을 위한 유용한 도구임을 나타냅니다. 그러나 ChrimsonR이 블루 라이트로 쉽게 활성화되어 크로노스와 동일한 청색광 활성화임계값을 표시하는 것으로 나타났습니다.
이 프로토콜의 경우 입체 좌표가 올바른지 확인하고 바이러스가 대상 뇌 영역에서만 표현되었는지 확인하는 것이 가장 중요합니다. 크로노스 ChrimsonR viroconstruct을 다른 바이러스와 교환함으로써, 예를 들어, 세포 특정 플렉스 바이러스, 수술 프로토콜을 변경하지 않고 여러 해부학적 또는 생리적 질문에 대답할 수 있다.
