이 프로토콜은 세포 분류 없이 복잡한 조직의 소수의 세포에서 고품질 세포 유형 특이적 RNA를 얻는 것을 목표로 합니다. 연구자들이 GLP 풀다운을 사용하여 리보솜 결합 RNA를 분리할 수 있도록 하는 최근 사용 가능한 마우스 모델을 사용합니다. 상기 방법은 또한 임의의 EGFP 발현 세포로부터 리보솜 결합 RNA를 단리하는데 적합하다.
시작하려면 유리 티슈 그라인더 세트에 2 밀리리터의 얼음처럼 차가운 균질화 작업 버퍼를 추가하십시오. 냉동 샘플을 분쇄기에 빠르게 넣고 느슨한 유봉을 사용하여 얼음 위에서 30 스트로크로 조직을 균질화하십시오. 균질 액을 2 밀리리터의 둥근 바닥 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10 분 동안 12, 000g에서 원심 분리합니다.
그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 새로운 2 밀리리터 튜브로 옮기고 100 마이크로 리터를 입력으로 예약합니다. 항-GFP 항체와 함께 상청액을 섭씨 4도에서 밤새 회전근의 끝에서 배양합니다. 균질액과 항체 혼합물을 세척된 단백질 g 비드를 함유하는 새로운 2밀리리터 둥근 바닥 튜브로 옮기고, 2시간 동안 24RPM의 회전기에서 섭씨 4도 인큐베이션하였다.
마그네틱 랙을 사용하여 상청액으로부터 마그네틱 비드를 분리한다. 상청액을 EGFP 음성 세포의 RNA와 리보솜에 결합되지 않은 EGFP 양성 세포의 RNA를 포함하는 음성 분획으로 저장합니다. 비드에 1 밀리리터의 고 염 세척 버퍼를 추가하고 튜브를 간단히 와동시켜 비드를 세척합니다.
그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 세척 완충액을 제거하고 세척 단계를 2회 더 반복하여 EGFP 양성 세포로부터 비드 리보솜 RNA 복합체를 얻었다. 비드를 RNA 분리 키트의 추출 버퍼 50마이크로리터와 함께 써모믹서에서 30분 동안 인큐베이션하여 비드에서 RNA를 방출합니다.
마그네틱 랙으로 비드를 분리하고 상층액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브를 3000g에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 피펫팅합니다.
RNA 정제 컬럼을 사전 컨디셔닝하기 위해, 250 마이크로리터의 컨디셔닝 버퍼를 정제 컬럼 상에 피펫팅하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 컬럼을 16, 000g에서 1 분 동안 원심 분리합니다. 동일한 부피의 70% 에탄올을 세포 추출물에 피펫팅하고 피펫팅하여 잘 혼합합니다.
최대 200 마이크로리터의 혼합물을 사전 조절된 RNA 정제 컬럼에 피펫팅합니다. 샘플 손실을 줄이려면 용량의 80 % 이상 열을 채우지 마십시오. 모든 RNA가 각 분획의 동일한 컬럼에 수집될 때까지 이 단계를 여러 번 반복합니다.
컬럼을 2분 동안 원심분리하여 컬럼 내의 멤브레인에 RNA를 결합시킨다. 그런 다음 30 초 동안 원심 분리를 계속하십시오. 유동을 버리고 100 마이크로리터의 세척 완충액을 피펫팅하여 컬럼 내로 넣는다.
1 분 동안 원심 분리한 다음 흐름을 폐기하십시오. 피펫 75 마이크로리터의 DNA 용액을 정제 컬럼 멤브레인에 직접 혼합합니다. 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.
이어서, 40 마이크로리터의 세척 완충액 하나를 컬럼 내로 피펫팅하고 또 다른 30초 동안 원심분리한다. 통과 흐름을 폐기합니다. 피펫 100 마이크로리터의 세척 완충액 2개를 컬럼에 넣고 8, 000 g에서 1분 동안 원심분리한다.
통과 흐름을 폐기합니다. PET 100 마이크로 리터의 세척 완충액 2 개를 컬럼에 넣고 16, 000 g에서 2 분 동안 원심 분리한다. 유동을 버리고, 동일한 컬럼을 16, 000 g에서 1분 동안 다시 원심분리하여 세척 완충액의 모든 미량을 제거한다.
컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 피펫 팁이 멤브레인에 닿지 않도록 정제 컬럼의 멤브레인에 직접 12 마이크로 리터의 RNase 자유수를 피펫합니다. 실온에서 1 분 동안 배양하고 1000g에서 1 분 동안 원심 분리합니다.
그 후 16, 000 G에서 1분 동안 RNA를 용출시켰다. 추출된 RNA의 품질과 양을 평가하기 위해 바이오분석기를 사용하십시오. RNA를 80도 냉동고에 보관하거나 추가 분석을 위해 보내십시오.
유전자 조작 유전자 대립 유전자 인 Gli1-CreERT2와 NuTRAP을 모두 보유한 마우스는 하루에 한 번, 격일로 3 회 주사 할 때 타목시펜을 주사합니다. 수집 된 조직의 면역 형광 분석은 EGFP가 고환의 간질 세포에서 발현되었음을 보여줍니다. EGFP는 또한 NuTRAP 마우스인 Gli1-CreERT2의 부신 캡슐 세포에서 발견되었습니다.
소닉 헤지혹-CreERT2에서 NuTRAP 마우스 EGFP 양성 세포 집단은 캡슐 아래 부신의 외부 피질에 상주하여 EGFP 사전 발현 세포의 발현을 확인합니다. 세포 유형 특이적 RNA를 추출한 후, 추출된 RNA를 마이크로어레이 분석을 위해 보냈다. 결과는 음성 분획의 유전자에 비해 약 3000 개의 유전자가 양성 분획에서 풍부 한 반면, 약 4, 000 개의 유전자가 음성 분획에서 풍부하다는 것을 보여 주었다.
차등적으로 발현된 유전자 중에서, 라이디히 세포 관련 유전자 Hsd11b1 및 Hsd3b6은 양성 분획에서 풍부하였다. 음성 분획에서, Sertoli 세포 관련 유전자 사막 고슴도치 및 Gstm6이 풍부 해졌다. 음성 분획을 입력과 비교할 때 몇 가지 차등적으로 발현된 유전자만이 확인되었습니다.
실시간 정량 RT-PCR을 이용하여 양성 및 음성 분획에서 핵심 유전자의 발현을 확인하였다. 마이크로어레이 분석에서 발견된 것과 유사하게, 스테로이드 생성 효소 3-베타 하이드록시스테로이드 탈수소효소 및 콜레스테롤 측쇄 절단 효소가 양성 분획에서 풍부하게 나타났다. 한편, Sertoli 세포 마커 SRY 박스 전사 인자 9 및 생식 세포 마커 시냅톤 복합체 단백질 3은 음성 분획에서 풍부하게 나타났다.
이 프로토콜을 시도할 때 사용하기 전에 DTT, 사이클로헥시미드 재조합 리보뉴클레아제 및 프로테이나제 억제제 칵테일을 균질화 스톡 용액에 추가하는 신선한 균질화 작업 완충액을 준비하는 것이 중요합니다. 사용하기 전에 신선한 저염과 고염 세척 완충액을 준비하는 것도 중요합니다.
