우리의 프로토콜을 사용하면 생물학적 부분 간의 관계를 더 쉽고 빠르게 이해할 수 있습니다. 단일 웰에서 부품의 여러 비율 메트릭 조합의 동작을 테스트할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 기존 접근 방식보다 더 큰 실험 효율성으로 회로 구성 요소 간의 복잡한 관계를 보다 포괄적으로 특성화할 수 있습니다.
이 방법은 합성 생물학 및 모든 생물학적 질문에 적용할 수 있으며, 유세포 분석을 통해 출력을 측정할 수 있는 다양한 수준의 형질주입된 유전자에 대한 반응으로 세포의 행동 변화를 조사합니다. 색상 제어 없음, mKO2 제어, TagBFP 제어, 네온 그린 제어, 모든 색상 제어, 폴리-형질주입 믹스 1 및 폴리-트랜스펙션 믹스 2로 표시된 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 따로 보관하여 각 DNA 응집체에 대한 튜브 준비를 시작합니다. 36 마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 무색 대조군, mKO2 대조군, TagBFP 대조군, 네온 그린 대조군 및 모든 색상 대조군 튜브에 첨가한 다음, 18 마이크로리터의 감소된 혈청 배지를 각각의 폴리-형질주입 믹스 1 및 폴리-형질주입 믹스 2 튜브에 첨가한다.
다음으로, 600 나노그램의 필러 플라스미드를 무색 제어 튜브에, 300 나노그램의 mKO2 및 300 나노그램의 필러 플라스미드를 mKO2 색상 제어 튜브에 추가하고, 300 나노그램의 TagBFP 및 300 나노그램의 필러 플라스미드를 TagBFP 컬러 컨트롤 튜브에 추가한다. 네온 그린 색상 제어 튜브에 구성 네온 그린 300나노그램과 필러 플라스미드 300나노그램을 추가한 다음 각 mKO2, TagBFP, 구성 네온 그린 및 필러 플라스미드 300나노그램을 모든 색상 제어 튜브에 추가합니다. 폴리형질주입 믹스 하나의 튜브에 150 나노그램의 mKO2, 75 나노그램의 리포터 네온 그린 플라스미드 및 75 나노그램의 필러 플라스미드를 첨가한다.
폴리-형질주입 믹스 2개의 튜브에, 150 나노그램의 TagBFP, 75 나노그램의 L7Ae 플라스미드 및 75 나노그램의 필러 플라스미드를 첨가한다. 완료되면 216마이크로리터의 환원된 혈청 배지와 9.48마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 결합하여 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에서 트랜스펙션 마스터 믹스를 만듭니다. 따로 보관하기 전에 피펫을 위아래로 잘 섞습니다.
1.58 마이크로리터의 인핸서 시약을 무색 제어, 단색 제어 및 모든 색상 제어 튜브에 첨가하고 79 마이크로리터의 인핸서 시약을 각각의 폴리-형질주입 혼합 튜브에 첨가한다. 각 튜브를 피펫팅으로 개별적으로 혼합합니다. 37.58마이크로리터의 트랜스펙션 마스터 믹스를 무색 대조군, 단색 대조군 및 모든 색상 조절 튜브에 추가하고 강력하게 피펫팅하여 혼합합니다.
다음으로, 18.79 마이크로리터의 형질주입 마스터 혼합물을 각각의 폴리-형질주입 혼합 튜브에 첨가하고, 각 튜브를 활발한 피펫팅으로 잘 혼합한다. 무색, 단색 및 모든 색상 대조군에 대한 각각의 형질주입 믹스 65.97 마이크로리터를 피펫팅하여 형질주입 믹스를 웰 내로 분주한 다음, 32.98 마이크로리터의 폴리형질주입 믹스를 폴리형질주입 웰 내로 옮기고, 플레이트를 팽팽하게 그러나 부드럽게 소용돌이킴으로써 복합체를 효과적으로 분배하고, 평평한 표면을 따라 패턴을 피구레이트한 다음, 32.98 마이크로리터의 폴리형질주입을 동일한 폴리형질주입 웰에 2개씩 혼합하고 동일한 방식으로 플레이트를 소용돌이친다. 이틀 동안 세포를 배양하십시오.
유세포 분석을 수행하여 각 세포에 대한 transfection marker 및 출력 리포터의 형광을 판독합니다. 비디오에 표시된 폴리-형질감염과 구별되는 잘 수행된 동시형질감염은 TagBFP와 EYFP 사이의 긴밀한 상관관계를 보여주며, 동시-전달된 플라스미드를 발현합니다. 대조적으로, 저조하게 수행된 공동-형질감염은 2개의 플라스미드 사이의 불량한 상관관계를 나타낸다.
잘 수행된 폴리형질감염은 2차원 공간의 양호한 커버리지 및 형광 단백질 사이의 스펙트럼 블리드의 양호한 보상을 보여주었다. 적은 수의 살아있는 세포를 갖는 폴리형질감염 데이터는 분석을 위해 각 빈에 충분한 수의 세포를 갖는 충분한 빈으로 세분하는 것이 어려웠다. 형질주입 효율이 좋지 않은 폴리형질주입은 분석을 위한 2차원 공간의 희박한 커버리지를 초래했습니다.
출력 발현에 대한 효과적인 DNA 비율은 억제 단백질인 L7Ae와 mKO2 및 출력 단백질인 네온 그린과 TagBFP를 별도의 형질주입 혼합물에 배치하여 테스트했습니다. 이어서, 네온 그린 발현을 mKO2 및 TagBFP의 상이한 수준에서 모니터링하였다. 공동형질감염 및 폴리형질감염 결과를 이 회로에 대해 비교하였다.
이전에 표시된 DNA 부분을 결합한 11개의 개별 공동 형질감염 결과를 단일 데이터 세트로 수집하고 폴리형질주입 데이터와 비교했습니다. 출력 리포터를 억제하는 L7Ae의 용량 반응 곡선의 비교는 빈당 평균 출력 레벨이 공동형질감염 및 폴리형질감염 데이터 사이에서 매우 유사하다는 것을 보여주었다. 폴리-형질감염의 성공적인 적용은 세포 유형 분류자를 최적화하기 위해 입증되었다.
HeLa 세포와 not-HEK 세포에 존재하는 마이크로 RNA-21은 BM3R1이 회로 출력 mKO2의 생성을 억제하기 때문에 BM3R1의 발현을 녹다운시키는 역할을 합니다. 마이크로 RNA 21이 세포에 존재하면 mKO2 발현이 켜집니다. Gal4-VP16의 양은 BM3R1의 낮은 수준에서 mKO2 발현을 조정합니다.
각 회로 구성 요소는 다른 형광 마커와 함께 전달되었습니다. 이 폴리-형질감염은 각 세포가 받은 각 회로 성분의 양을 정량화합니다. mKO2는 MIR21에서 생산되어 HeLa 세포를 생성하지만 HEK 세포에서는 생성하지 않습니다.
mKO2 출력은 특정 세포에 의해 수신된 각 회로 성분의 양을 나타내기 위해 별개의 형광 리포터와 함께 별도의 형질감염 혼합물로 이들 회로 성분을 전달한 후 분석되었습니다. 이 하위 샘플링은 HEK293 대 HeLa 세포를 분류할 때 이 비율에서 공동 형질주입된 회로가 91%의 특이도, 62%의 민감도 및 77%의 정확도를 가질 것으로 예측했습니다. 이 프로토콜에서 가장 일반적인 문제점은 각 형질주입 믹스 내에서 긴밀한 상관관계가 없다는 것입니다.
따라서 인핸서 시약을 첨가한 직후 형질주입 튜브를 격렬하게 혼합한 다음, 형질주입 혼합물을 함유한 지질을 첨가한 후 형질주입 튜브를 부드럽게 혼합하고 피펫팅하는 것을 잊지 마십시오. 이 절차의 유전적 구성 요소는 다양한 환경에서 기능 성능에 대한 질문에 답하기 위해 다른 유전 구성 요소로 대체될 수 있습니다. 이 방법은 세포 분류자, 피드백 및 피드포워드 컨트롤러, 쌍안정 모티프 등과 같은 유전 회로를 빠르게 발전시켰습니다.
