본 연구는 주로 DNA 복구와 노화 사이의 연관성에 초점을 맞추고 있습니다. 구체적으로 말하자면, 우리는 다양한 층병증 질환을 살펴보고 이러한 질환이 DNA 복구에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 배우고자 합니다. 우리는 허친슨-길포드 조로증 증후군으로 알려진 조기 노화 및 짧은 수명과 관련된 층병증 장애가 실제로 DNA 손상의 증가 및 부정확한 DNA 복구와 관련이 있음을 입증했습니다.
본 연구실에서는 얇은 판병증 환자에 대한 잠재적 치료법의 효과를 조사하여 이러한 접근 방식이 DNA 복구 및 DNA 손상에도 긍정적인 영향을 미치는지 알아보고자 합니다. 시작하려면 집게를 사용하여 멸균 6웰 플레이트의 각 웰에 하나의 커버 슬립을 놓습니다. 2ml의 보충제를 6웰 플레이트의 각 웰에 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 추가합니다.
플라스크에서 배양된 HeLa 세포의 배지를 흡인하고 15ml의 PBS를 첨가하여 세포를 세척합니다. 플라스크를 부드럽게 휘둘러 세포를 세척하고 PBS를 흡인하고 2ml의 트립신-EDTA를 추가하여 세포를 코팅합니다. 트립신으로 코팅된 플라스크를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에 2분 동안 넣어 세포가 분리될 수 있도록 합니다.
그런 다음 트립신화된 세포와 피펫을 위아래로 여러 번 주입하여 응집된 세포를 분리하는 플라스크에 보충된 DMEM 8ml를 추가합니다. 플라스크에서 세포 현탁액을 15ml 폴리스티렌 튜브로 수집합니다. 세포를 계수한 후 500, 000개의 세포를 6웰 플레이트의 각 커버 슬립에 직접 한 방울씩 추가합니다.
플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 가습 인큐베이터에 넣어 세포가 하룻밤 동안 자랄 수 있도록 합니다. 세포 고정을 위해 다음날 6-well plate의 well에서 매체를 흡입합니다. 각 웰에 2ml의 PBS를 추가하여 세포를 세척하고 웰에서 모든 PBS를 완전히 흡인합니다.
그런 다음 실온에서 10분 동안 각 웰에 4% 포름알데히드 용액 2밀리리터를 추가하고 웰에서 용액을 완전히 흡인합니다. 다음으로, 각 웰에 2ml의 투과화 용액을 추가합니다. 용액을 실온에서 10분 동안 그대로 두었다가 완전히 흡인합니다.
각 웰에 2ml의 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 매번 씻은 후 완전히 흡입하십시오. 웰에서 모든 PBS를 흡인하면 각 웰에 2ml의 항체 희석제 완충액(ADB)을 추가하여 면역형광 염색을 위해 세포를 차단합니다.
실온에서 30분 동안 부드러운 안와 쉐이킹으로 배양합니다. 블로킹 기간이 끝나갈 무렵. ADB에서 루멘 B1 및 이중 가닥 DNA 항체를 혼합하여 1차 항체 희석을 준비합니다.
배양이 끝나면 우물에서 ADB를 흡인합니다. 평평한 표면에 파라핀 필름 조각을 테이프로 감아 처리 중인 모든 커버 슬립을 수용할 수 있을 만큼 영역이 충분히 큰지 확인합니다. 각 커버 슬립에 대해 1차 항체 희석액 75마이크로리터를 파라핀 필름에 피펫팅하여 기포를 방지합니다.
집게를 사용하여 각 커버 슬립 셀 면이 아래로 향하게 하여 항체 방울에 놓습니다. 인큐베이팅 커버 슬립을 6웰 플레이트의 뚜껑으로 덮고 커버 슬립을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 파라핀 필름에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 셀 면이 위를 향하도록 하여 6웰 플레이트에 다시 넣습니다.
커버 슬립을 PBST 2밀리리터로 5분 동안 세 번 흔들어 세척합니다. 최종 세척 중에 2차 항체 희석액을 준비합니다. 마지막 세척 후 PBST를 완전히 흡인합니다.
파라 필름에 2차 항체를 추가하고 커버 슬립을 파라핀 필름에 놓고 세포 면이 아래로 향하게 합니다. 그런 다음 커버 슬립 위에 가벼운 보호 덮개를 씌워 세포를 빛으로부터 보호하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 겸자를 사용하여 파라핀 필름에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 6웰 플레이트에 다시 넣고 셀 측면이 위를 향하도록 한 다음 웰에 각각 2밀리리터의 70%90%와 100%에탄올을 순차적으로 첨가하여 커버 슬립을 탈수하여 각 용액이 제거하기 전에 1-2분 동안 그대로 두십시오.
집게를 사용하여 우물에서 덮개 슬립을 제거하고 보푸라기가 없는 물티슈에 올려 놓고 빛으로부터 보호하여 자연 건조시킵니다. 커버 슬립당 20마이크로리터의 장착 매체를 사용하여 커버 슬립을 유리 현미경 슬라이드에 슬립 셀 면을 아래로 장착합니다. 핵 기포는 HeLa 대조 세포의 17%에 비해 약 50%의 핵이 기포를 보이는 HeLa ZMPST24 녹아웃 세포에서 더 널리 퍼졌습니다.
DNA 누출은 HeLa ZMPSTE24 녹아웃 세포에서 주로 관찰되었으며, HeLa 대조 세포에서는 DNA 누출이 관찰되지 않았지만 눈에 보이는 핵 블리빙이 없는 경우에도 일부 ZMPSTE24 녹아웃 세포에서 DNA 누출이 발생했습니다.
