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Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

Resumo

Uma primeira abordagem para estudar a função de um gene desconhecido em bactérias é criar um knock-out deste gene. Aqui, descrevemos um protocolo robusto e rápido para transferência de mutações do gene exclusão de uma estirpe de Escherichia coli para outro usando transdução generalizada com o bacteriófago P1. Este método requer que a mutação seja selecionável (por exemplo, baseado em interrupções de gene usando inserções de gaveta antibiótico). Tais fitas antibióticas podem ser mobilizadas a partir de uma estirpe de doador e introduziram uma destinatário estirpe de interesse para rapidamente e facilmente geram um mutante de apagamento do gene. A gaveta antibiótica pode ser projetada para incluir sites de reconhecimento de flipase que permitem que a excisão da fita por um site-specific recombinase para produzir um nocaute limpo com apenas uma sequência de ~ 100-base-par-longa cicatriz no genoma. Demonstramos o protocolo ao nocautear o gene de tamA codifica um fator de montagem envolvido na biogênese de autotransporter e testar o efeito desse nocaute sobre a biogênese e a função de dois autotransporter trimeric adesinas. Embora a supressão do gene por transdução P1 tem suas limitações, a facilidade e rapidez de sua implementação seja uma alternativa atraente para outros métodos de apagamento do gene.

Introdução

Uma primeira abordagem comum para estudar a função de um gene é executar o mutagenesis de mata-mata e observar o fenótipo resultante. Isto também é denominado genética reversa. A bactéria e. coli tem sido o carro-chefe da biologia molecular nos últimos 70 anos, ou então, devido à facilidade do seu cultivo e sua acessibilidade para manipulação genética1. Vários métodos foram desenvolvidos para produzir exclusões de gene em e. coli, incluindo troca de marcador a mutagênese2,3 e, mais recentemente, recombineering usando o λ vermelho ou Rac ET sistemas4,5 , 6.

Em um sistema amplamente utilizado, codificação de sequências de genes individuais são substituídas por uma gaveta de resistência aos antibióticos que pode mais tarde ser extirpada do cromossoma5,7. As sequências de codificação são substituídas, por exemplo, uma gaveta de resistência de canamicina (Kan), que é ladeada por sites de destino (FRT) de reconhecimento de flipase (FLP) em ambos os lados. Os sites da FRT são reconhecidos pela recombinase FLP, que medeia a site-specific recombinação entre os sites FRT, levando à supressão da fita Kan. Desta forma, uma exclusão total de sequência de código de um determinado gene pode ser conseguida, deixando para trás apenas uma sequência de cicatriz mínima de aproximadamente 100 pares de bases (bp) (Figura 1).

Pouco mais de uma década atrás, foi desenvolvida a coleção chamada de Keio. Esta é uma biblioteca bacteriana com base em um padrão de laboratório cepa de Escherichia coli K12, onde quase todos os genes não essenciais foram individualmente excluídos por λ recombinação vermelho7,8. Os clones dentro de cada coleção tem uma sequência de código substituída com uma gaveta de resistência Kan sujeitas. A coleção de Keio provou para ser uma ferramenta útil para muitas aplicações9. Uma tal aplicação é a produção de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . A gaveta de Kan de um clone de exclusão determinada pode ser mobilizada por geralmente transducing bacteriófagos, tais como P110,11,12,13,14. Um estoque de fago preparado a partir de uma tensão tão grande pode ser usado para infectar um destinatário Escherichia coli cepa de interesse, onde em uma frequência baixa, mas de confiança o Kan região contendo gaveta pode ser incorporada o genoma destinatário por recombinação homóloga (Figura 2). Transductants podem ser selecionados para o crescimento em meio de Kan-contendo. Em seguida, se a remoção da fita resistência aos antibióticos é desejada, a recombinase FLP pode ser fornecido para a estirpe transductant em trans. Após a cura o plasmídeo contendo FLP, que transporta um marcador de resistência a ampicilina (Amp), clones de Kan e Amp-sensíveis são selecionados para, e a correta excisão de sequência de codificação a selvagem-tipo e a gaveta de Kan são verificadas por PCR de colônia.

Aqui, é apresentado um protocolo detalhado, descrevendo cada uma das etapas na produção de uma estirpe de Escherichia coli , baseado na estratégia delineada acima de mata-mata. Como exemplo, uma deleção do gene da tamA é demonstrada. tamA codifica uma proteína de β-barril de membrana exterior que é uma parte do transporte e módulo de montagem (TAM), que está envolvida na biogênese de certas proteínas autotransporter e pili15,16,17. Esta estirpe de mata-mata foi usado para examinar o efeito da exclusão tamA sobre a biogênese de dois autotransporter trimeric adesinas (TAAs), a Yersinia adesina YadA e a Escherichia coli imunoglobulinas (Ig)-vinculação TAA EibD 18,19.

Protocolo

1. cepas e plasmídeos

  1. Estirpes bacterianas
    1. Use a e. coli as estirpes BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20e BL21ΔABCF21. Consulte Tabela de materiais para mais informações.
  2. Bacteriófagos
    1. Use o fago P1vir para a transdução geral. Armazenar a Praga como um estoque líquido com algumas gotas de clorofórmio (consulte a etapa 2.2). Para obter mais informações, consulte Tabela de materiais.
  3. Plasmídeos
    1. Use os seguintes plasmídeos neste protocolo: pCP2022, pIBA2-YadA23e pEibD1024. Como plasmídeos de controle, use pASK-IBA2 e pET22b (ver Tabela de materiais).
  4. Condições de crescimento
    1. Propaga as bactérias em um lisogenia caldo (LB) médio25 com agitação vigorosa (180 – 200 rpm) a 37 ° C ou 30 ° C, no caso de tensões que contém pCP20 e BL21ΔABCF.
    2. Executar o plasmídeo curando a 43 ° C.
    3. Para um meio sólido, suplemento LB com ágar de 1% (p/v).
    4. Para ágar superior, suplemento LB com 0,7% agar e 10 mM CaCl2 e autoclave a médio. Use meio de SOC para a recuperação após electroporation26.
    5. Use as seguintes concentrações de antibióticos: 100 μg/mL para o Amp e 25 μg/mL para Kan.

2. preparar um Phage lisado

  1. Infecção da estirpe dos doadores
    1. Crescer a tensão do doador JW4197 em 5 mL de LB suplementado com 10 mM CaCl2 e opcionalmente com Kan (25 µ g/mL) para uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Medir o valor de600 OD usando um espectrofotômetro.
    2. Fazer uma série de diluição de um stock de fago P1 existente no meio de LB: recomendado diluições são entre 10-3 a 10-7.
    3. Mix de 200 μL da suspensão bacteriana e 100 μL de uma diluição do fago determinado em um tubo de centrífuga de 15 mL ou equivalente. Prepare os tubos como muitos como diluições do fago. Incube os tubos por 20 min a 37 ° C, sem agitação.
    4. Adicionar ~ 3 mL de ágar superior fundido (~ 50 ° C) suplementado com 10 mM CaCl2 para os tubos, homogeneizar o conteúdo vortexing dos tubos em breve e despeje as misturas em placas LB escaldadas para fazer camadas mesmo.
    5. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.
  2. Lisado preparação
    1. No dia seguinte escolha uma placa com um crescimento semi confluente de placas do fago. Em um prato semi confluente, aproximadamente metade da área de superfície da placa é evidente (Figura 3).
    2. Raspar a camada superior de ágar de tal uma placa usando um loop de inoculação ou uma ferramenta semelhante e coloque o ágar superior num tubo de centrífuga. Adicionar 1 a 2 mL de LB e uma gota de clorofórmio e vortex o tubo vigorosamente para ~ 1 min Add o clorofórmio em uma coifa.
    3. Centrifugar o tubo durante 15 minutos a 4.000 x g ou mais rápido para o agar e células bacterianas de Pelotas.
    4. Mova o sobrenadante para um tubo de microcentrifugadora fresco, evitando carregando ao longo de todos os restos da pelota. Adicione 2 gotas de clorofórmio e armazenar o lisado 4 e 10 ° c. Adicione clorofórmio em uma coifa. Não congele o fago lisado como isso irá resultar em uma redução significativa do número de partículas infecciosas.
  3. Determinação do título de lisado
    1. Cresce BW25113 em LB suplementado com 10 mM CaCl2 a 37 ° C até a cultura atinge uma OD600 ~ 1.0.
    2. Prepare uma série de diluição do fago lisado em LB (por exemplo, 10-6– 10-9).
      Nota: Tenha cuidado para pipetar amostra do topo do lisado para evitar a transferência de clorofórmio para as diluições.
    3. Mix de 200 μL da suspensão bacteriana e 100 μL de uma diluição do fago determinado em um tubo de centrífuga de 15 mL ou equivalente. Prepare os tubos como muitos como diluições do fago. Incube os tubos por 20 min a 37 ° C, sem agitação.
    4. Adicionar ~ 3 mL de ágar superior fundido (~ 50 ° C) suplementado com 10 mM CaCl2 para os tubos, homogeneizar o conteúdo vortexing dos tubos em breve e despeje a mistura em placas LB escaldadas para fazer camadas mesmo.
    5. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.
    6. No dia seguinte contar o número de placas (regiões claras na esteira da bacteriana) por cada placa e calcular o título do lisado, usando a seguinte fórmula:
      figure-protocol-4980
      Exemplo: Em placas com as diluições 10-7, 10-8e 10-9, existem 231, 27 e 2 placas, respectivamente. Como 100 μL de cada diluição foi utilizado para a infecção, e porque o título é expresso como formadoras de placa unidades (pfu) / mL, o fator do chapeamento é 10. Estes números são inseridos na fórmula:
      figure-protocol-5388
      Assim, o título é aproximadamente 2 x 1010 do fago infecciosas partículas/mL.

3. P1 transdução

  1. Preparando as células destinatários
    1. Crescer o destinatário estirpe BL21ΔABCF em LB suplementado com uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de ~ 1.0. Use um espectrofotômetro para medir o valor de600 OD.
    2. Calcule o volume do fago lisado necessário para a realização de uma multiplicidade de valor de infecção (MOI) de 0,5. Para calcular o MOI, estime o número de bactérias baseada o OD600 da cultura. Suponha que um valor de600 OD de 1.0 corresponde ~ 109 UFC/mL. Calcule o volume necessário com base do título conhecido do lisado.
      Exemplo (com base do título calculado no exemplo após etapa 2.3.6):
      figure-protocol-6318
    3. Adicione o CaCl2 para a cultura de estirpe destinatário a 10 mM e misture. Tome 1 mL da cultura para a transdução.
  2. Realizando a transdução
    1. Adicionar o volume apropriado do fago lisado a 1 mL de cultura destinatário (incluindo CaCl2 a 10 mM), conforme calculado no passo 3.1.2 e misture delicadamente.
      Nota: Tenha cuidado para pipetar amostra do topo do lisado para evitar transferir clorofórmio à mistura.
    2. Estaticamente, incubar a mistura por 20 min a 37 ° C.
    3. Pare a infecção pela adição de citrato de sódio, pH 5,5 a 100 mM.
    4. Centrifugar as bactérias (5.000 x g por 2 min) e remover o sobrenadante e, em seguida, resuspenda-los em 1 mL de fresco LB suplementado com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5.
    5. Lave as células mais duas vezes como na etapa 3.2.4 para garantir a remoção do fago livre e cálcio.
    6. Ressuspender as bactérias em 1 mL de fresco LB suplementado com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5. Incube a bactéria a 30 ° C, durante 1 h com agitação (> 100 rpm).
    7. Recolher as bactérias por centrifugação (5.000 x g por 2 min) e Resuspenda-los em ~ 100 μL de LB com citrato de sódio de 100 mM, pH 5,5.
    8. Espalhar as bactérias em uma placa LB suplementado com Kan a 25 µ g/mL e citrato de sódio de 10 mM, pH 5,5 e crescer a bactéria a 30 ° C até colônias aparecem (~ 24 h).
  3. Selecionando as transductants
    1. Uma vez que as colónias têm crescido na placa de seleção, restreak-los na LB + Kan para colônias única e crescer a 30 ° C até colônias única aparecem.

4. extirpando a gaveta de Kan

  1. A transformação com plasmídeo de recombinação
    1. Fazer o electrocompetent de estirpe BL21ΔABCF Kan-resistente.
      1. Crescer a tensão de uma única colônia em fresco LB (5 mL), suplementado com Kan (25 µ g/mL) a 30 ° C até que o OD600 ~0.5-0,7.
      2. A partir daqui, execute as etapas a seguir a 4 ° C ou em gelo. Centrifugar as bactérias (5.000 x g durante 10 minutos) e remover o sobrenadante.
      3. Lave o centrifugado com água destilada gelada duas vezes, repetindo o passo anterior de centrifugação e, finalmente, resuspenda o pellet de células em 100 µ l de gelado 10% de glicerol.
    2. Arrefecer cubetas de eletroporação de 1 mm no gelo.
    3. Adicionar 1 pg de plasmídeo (pCP20) para a suspensão de eritrócitos, misture-os delicadamente a suspensão e transferi-lo para uma cubeta de eletroporação de refrigeração.
    4. Definir o electroporator para 1,8 kV e electroporate as células.
    5. Resgate de células transformadas, adicionando 1 mL de meio SOC e fazê-los crescer por 1h a 30 ° C.
    6. Placa de 100 µ l de células na LB + Amp placas e crescer as células a 30 ° C durante a noite.
  2. Indução da recombinação
    1. Palheta simples colônias do LB + Amp placa e inocular fresco LB, omitindo todos os antibióticos.
    2. Crescem as células à temperatura não-permissivo (43 ° C) durante a noite para induzir a expressão de recombinase FLP.
  3. Seleção de recombinantes
    1. Fazer diluições em série e 50 µ l de uma diluição de6 105-10 em placas não-seletivo da placa e cultivá-lo durante a noite a 30 ° C.

5. verificação da exclusão Gene

  1. Verificação da perda do plasmídeo e recombinação de sucesso
    1. Colônia de raia única dos pratos preparados na etapa 4.3.1 na LB Kan, LB + Amp e placas LB sem antibióticos, nesta ordem. Para ajudar as estrias, usar uma grade de Colônia (ver arquivo complementar 1). Crescem as placas a 30 ° C até colônias aparecem (~ 24 h).
    2. Pegue 10 – 20 clones que têm crescido na placa não-seletivo, mas não conseguiram crescer na mídia seletiva para posterior verificação.
  2. Verificação suplementar por PCR de colônia
    1. Realizar uma colônia PCR com primers flanqueando o tamA sequência de código (consulte a Tabela de materiais).
    2. Prepare uma mistura PCR a mestre. A quantidade de mistura necessária depende do número de colónias a ser testado (Veja o exemplo na tabela 1). Misture os reagentes no gelo, adicionar o polymerase última.
    3. Homogeneizar a mistura de mestre de PCR e, em seguida, diluir 20 µ l em tubos de uma tira PCR. Pegue uma pequena quantidade de cada colônia para ser exibido usando uma ponta de pipeta estéril e adicioná-lo para um tubo. Lembre-se de incluir a estirpe de destinatário original para comparação. Opcionalmente, também inclua a estirpe do doador.
    4. Executar uma reação de PCR (ver tabela 2 para o programa utilizado).
    5. Prepare um gel de agarose a 1%.
      1. Para um gel 50 mL, medir 0,5 g de agarose e adicionar 50 mL de tampão TAE (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM e 1 mM EDTA, pH 8.0). Aqueça a mistura em um forno de microondas até dissolver toda da agarose.
      2. Uma vez que a agarose dissolveu, arrefecer a solução para cerca de 50 ° C e adicione 5 μL de DNA coloração tintura. Misture a solução bem e despeje em uma bandeja de gel em uma câmara de fundição. Insira uma ou mais linhas de pentes bem assim há poços suficientes para todas as amostras, bem como marcadores de tamanho molecular. Permitir que o gel definir por 30 min.
    6. Uma vez concluída a execução PCR, adicione 4 µ l de 6 x tintura do carregamento de DNA de cada amostra. Colocar o gel na câmara de eletroforese e adicionar tampão TAE até os poços estão cobertos.
    7. Aplica 10 a 15 µ l de cada reação de PCR para um poço no gel. Também Adicione 5 µ l de um marcador de tamanho molecular. Em seguida, execute o gel por 30 min a 75 V.
    8. Uma vez concluída a execução, o gel usando um gerador de imagens de luz azul da imagem.

6. outras técnicas

  1. Expressão da proteína
    Nota: A expressão de proteínas de teste (YadA e EibD) tem sido descrito em detalhe em outro lugar,23,24. Este é um breve resumo das principais etapas.
    1. Transformar BL21ΔABCF ΔtamA with os necessários plasmídeos (YadA-pIBA2 e pEibD10 e os correspondente plasmídeos de controle) e selecione para transformants na LB + Amp.
    2. Para a expressão da proteína, inocular 100 mL de meio LB + Amp 1ml da cultura de bactérias transformadas durante a noite e crescer estas a 30 ° C até a fase log de mid, momento em que, induzir a produção de proteína com qualquer anhydrotetracycline (a 100 ng/mL) ou thiogalactoside isopropílico (a 0,5 mM).
    3. Depois de 2h de indução a 30 ° C, medir a turbidez das culturas e coletar um número de células, correspondente a 50 mL no OD600 = 1.0 por centrifugação as culturas por 15 min a 4.000 x g. Lave o pellet 1x com 10 mM HEPES, pH 7,4 e em seguida ou armazená-lo a-20 ° C ou processo etapa 6.2 ainda mais.
  2. Extração de membrana externa
    Nota: Extração de membrana externa é realizada conforme descrito em detalhe por Leo et al . 27. as principais etapas estão resumidas a seguir.
    1. Ressuspender o pellet de células em 1 mL de 10 mM HEPES, pH 7,4, suplementado com 10 mM MgCl2 e MnCl2, lisozima (0,1 mg/mL) e uma pitada de DNase eu.
    2. Lise as células (por exemplo, usando um batedor do grânulo).
    3. Centrifugar as células em breve (2 min a 15.600 x g) para remover os detritos celulares e mover o sobrenadante para um tubo de fresco.
    4. Centrifugar as células por 30 min a 16.000 x g, após o qual, resuspenda o pellet em 400 μL de 1% N-lauroyl sarcosina em 10 mM HEPES, pH 7,4.
    5. Incube as celulas com agitação por 30 min à temperatura ambiente, após o qual, centrifugue-los durante 30 min como acima.
    6. Lave o translúcido da pelota 1x com 200 μL de 10 mM HEPES, pH 7,4, resuspenda-lo em 30 μL de 10 mM HEPES e adiciona 10 μL de tampão de amostra SDS-PAGE de 4x.
  3. Ensaios de atividade
    Nota: Realizar ensaios de SDS-PAGE e atividade para YadA e EibD como descrito28. As principais etapas estão resumidas a seguir.
  4. SDS-PAGE
    1. Aquece as amostras a 50 ° C por 5 min antes de carregá-los em um gel de poliacrilamida, para evitar a desnaturação das proteínas.
    2. Após a separação em SDS-PAGE, transferi as proteínas para uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno.
    3. Após a transferência, bloquear a membrana com pó de leite desnatado 2% em PBS.
  5. Borrão do extremo-oeste YadA-colágeno
    1. Após o bloqueio, adicionar tipo de colágeno bovino que diluído em tampão de bloqueio a uma concentração de 10 μg/mL e incubar a membrana por 1h.
    2. Lavar a membrana 2 x com PBS + 0,05% Tween20 (PBS-T).
    3. Adicione o anticorpo primário (anticorpo monoclonal anticolágeno COL-1) para a membrana, 1:2,000 diluído em tampão de bloqueio.
    4. Após a incubação da membrana por 1h, lave 2x como mencionado na etapa 6.3.2.2 e em seguida, adicione o anticorpo secundário [conjugado de peroxidase (HRP) de rábano-IgG de anticabra rato], 1:10,000 diluído em tampão de bloqueio.
    5. Incubar a membrana para 1 h e, em seguida, lave-o 2 vezes com PBS-T. Adicionar um substrato quimioluminescente reforçado para a membrana de acordo com as instruções do fabricante e detectar a banda usando uma câmera CCD.
  6. EibD-IgG ensaio
    1. Após o bloqueio, adicione um anticorpo secundário (de cabra anticoelho HRP), diluído 1:2,000 em tampão de bloqueio.
    2. Incubar a membrana para 1 h e, em seguida, lave-o 2 x com PBS. Execute a detecção quimioluminescente como mencionado na etapa 6.3.2.5.

Resultados

Geração de um tamA Knock-out de BL21ΔABCF:

A estratégia acima descrita anteriormente foi usada para produzir uma tensão derivada de BL21(DE3), uma estirpe de laboratório padrão usada para a produção de proteína, que é otimizada para a produção de proteínas de membrana exterior e chamada BL21ΔABCF21. Esta tensão não possui quatro genes que codificam para proteínas de membrana extern...

Discussão

Transdução de P1 é um método rápido, robusto e confiável para a geração de exclusões de gene em e. coli. Isso é demonstrado aqui pelo transducing um mutante de exclusão de tamA de uma estirpe de doador de Keio para um destinatário BL21-derivado. As grandes etapas do processo de transdução são a produção do transducing lisada, a transdução em si, a excisão da fita Kan resistência e a verificação do knock-out pelo PCR. No total, o processo leva cerca de 1 semana e requer sem método...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Cepas de coleção de Keio foram obtidas a partir do projeto nacional de BioResource (NIG, Japão): Escherichia coli. Agradecemos seu apoio contínuo Dirk Linke (departamento de Biociências, Universidade de Oslo). Este trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa da Noruega jovem pesquisador grant 249793 (Jack C. Leo).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Strains
E. coli BW25113NIGME6092Wild-type strain of Keio collection
E. coli BL21(DE3)Merck69450-3Expression strain
E. coli BL21DABCFAddgene102270Derived from BL21(DE3)
E. coli JW4179NIGJW4179-KCtamA deletion mutant
P1 virNIGHR16Generally transducing bacteriophage
Plasmids
pCP20CGSC14177conditionally replicating plasmid with FLP
pASK-IBA2IBA GmbH2-1301-000expression vector
pEibD10N/AN/Afor production of EibD; plasmid available on request
pET22b+Merck69744-3expression vector
pIBA2-YadAN/AN/Afor production of YadA; plasmid available on request
Chemicals
Acetic acidThermoFisher33209
AgarBD Bacto214010
AgaroseLonza50004
AmpicillinApplichemA0839
AnhydrotetracyclineAbcamab145350
anti-collagen type I antibody COL-1SigmaC2456
Bovine collagen type ISigmaC9791
Calcium chlorideMerck102382
ChloroformMerck102445
Di-sodium hydrogen phosphateVWR28029
DNA dyeThermoS33102
DNA molecular size markerNew England BioLabsN3232S
DNase ISigmaDN25
dNTP mixNew England BiolabsN0447
ECL HRP substrateAdvanstaK-12045
EDTAApplichemA2937
GlycerolVWR24388
goat anti-mouse IgG-HRPSanta Cruzsc-2005
goat anti-rabbit IgG-HRPAgriseraAS10668
HEPESVWR30487
Isopropyl thiogalactosideVWR43714
KanamycinApplichemA1493
LysozymeApplichemA4972
Magnesium chlorideVWR25108
Manganese chlorideSigma221279
N-lauroyl sarcosineSigmaL9150
Skim milk powderSigma70166
Sodium chlorideVWR27808
tamA forward primerInvitrogenN/ASequence 5'-GAAAAAAGG
ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'
tamA reverse primerInvitrogenN/ASequence 5'-TCATAATT
CTGGCCCCAGACC-3'
Taq DNA polymeraseNew England BiolabsM0267
Tri-sodium citrateMerck106448
TryptoneVWR84610
Tween20SigmaP1379
Yeast extractMerck103753
Equipment
Agarose gel electrophoresis chamberHoeferSUB13
Bead beaterThermoFP120A-115
CCD cameraKodak4000R
Electroporation cuvettesBio-Rad165-2089
Electroporation unitBio-Rad1652100
Gel imagerNippon GeneticsGP-03LED
Incubating shakerInfors HTMinitron
IncubatorVWR390-0482
MicrocentrifugeEppendorf5415D
Microwave ovenSamsungCM1099A
PCR machineBiometraTpersonal
PCR stripsAxygenPCR-0208-CP-C
pH meterHanna InstrumentsHI2211-01
PVDF membraneThermoFisher88518
SDS-PAG electrophoresis chamberThermoFisherA25977
Tabletop centrifugeBeckman CoulterB06322
Vortex mixerScientific IndustriesSI-0236
Water bathGFLD3006
Wet transfer unitHoeferTE22

Referências

  1. Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826 (2015).
  2. Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).
  3. Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).
  4. Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond. Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).
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