Procedimento de craniotomia para visualizar atividades neuronais no hipocampo de ratos comportadores

Resumo

Este artigo demonstra a preparação de uma janela de imagem personalizada complementada com cânula de infusão e sua implantação na região ca1 do hipocampo em camundongos.

Resumo

Imagens de atividades neuronais em resolução unicelular em animais de comportamento acordados é uma abordagem muito poderosa para a investigação de funções de circuito neural em sistemas neurociência. No entanto, alta absorção e dispersão de luz no tecido mamífero limitam a imagem intravital principalmente a regiões cerebrais superficiais, deixando áreas cerebrais profundas, como o hipocampo, fora do alcance da microscopia óptica. Neste vídeo, mostramos a preparação e implantação da janela de imagem personalizada para permitir imagens in vivo crônicas da região do CA1 hipocampal dorsal em camundongos comportados com cabeça fixa. A janela personalizada é suplementada com uma cânula de infusão que permite a entrega direcionada de vetores e medicamentos virais para a área de imagem. Combinando esta preparação com imagens de campo amplo, realizamos um registro a longo prazo da atividade neuronal usando um indicador de cálcio fluorescente de grandes subconjuntos de neurônios no comportamento de camundongos ao longo de várias semanas. Também demonstramos a aplicabilidade desta preparação para imagens de tensão com resolução de pico único. Indicadores geneticamente codificados de alto desempenho da atividade neuronal e câmeras CMOS científicas permitiram a visualização recorrente de detalhes morfológicos subcelulares de neurônios únicos em alta resolução temporal. Também discutimos as vantagens e limitações potenciais do método descrito e sua compatibilidade com outras técnicas de imagem.

Introdução

O hipocampo é uma região cerebral chave responsável pelo aprendizado e memória^1, bem como pela navegação espacial². A atrofia hipocampal está associada a distúrbios neurológicos e psiquiátricos envolvendo perda de memória e declínio cognitivo^3,4,5. Em camundongos, o hipocampo é um modelo muito bem estabelecido para estudar a formação de aprendizagem e memória espacial, contextual e associativa nos níveis celular e de rede^4,5. Os estudos mecanicistas de aprendizagem e memória requerem interrogatório longitudinal da estrutura neuronal e função no comportamento de camundongos. A imagem de fluorescência em combinação com sondas geneticamente codificadas⁶ fornece capacidades sem precedentes para registrar dinâmica de tensão de membrana^7,8, transitórios de cálcio⁹, e alterações estruturais¹⁰ sobre grandes subconjuntos de neurônios intravitalmente. No entanto, o acesso óptico ao hipocampo em camundongos é obstruído pelo córtex, que pode atingir mais de 1 mm de espessura. Aqui, descrevemos um procedimento para a montagem de um dispositivo de imagem personalizado e sua implantação crônica na cabeça do rato para acesso óptico de longo prazo à sub-região CA1 do hipocampo dorsal no comportamento de ratos. A cânula de infusão integrada ao implante de imagem permite a administração de vírus ou drogas diretamente nos neurônios no campo de visão. A preparação descrita em combinação com microscopia de campo largo permite imagens recorrentes dos grandes subconjuntos de neurônios no comportamento de camundongos por longos períodos de tempo. Utilizamos esta preparação para expressar indicadores geneticamente codificados de cálcio e tensão na região hipocampal de CA1 através da injeção direcionada de vírus adeno associado a adeno recombinante (rAAV) para registros de atividade neuronal em resolução unicelular. Também foram realizadas imagens longitudinal de cálcio dos subconjuntos neuronais correspondentes em alta resolução espacial em animais de comportamento. Além disso, essa preparação é compatível com microscopia multifotítula e microendoscopia, expandindo ainda mais a caixa de ferramentas de técnicas de imagem para estudar redes neuronais em níveis celulares e subcelulares no comportamento de camundongos. Descrevemos etapas críticas e solução de problemas do protocolo. Também discutimos as possíveis armadilhas e limitações do método.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Westlake.

1. Montagem de implantes

NOTA: A montagem do implante de imagem é tecnicamente simples e requer apenas itens disponíveis comercialmente(Figura 1, veja também Tabela de Materiais). As placas da cabeça podem ser fabricadas na oficina local usando placas de aço inoxidável ou titânio. Sugerimos preparar um estoque de implantes totalmente montados antes de iniciar as cirurgias. Após a 34, os implantes podem ser recuperados e reutilizados várias vezes. Em alguns casos, só pode exigir a religação da cânula de infusão soldando ou substituindo o vidro de cobertura.

1. Prepare todos os seis componentes de hardware principais para implantação e instalação de implantes de imagem(Figura 1).

Figura 1: Seis componentes de hardware chave para montagem e instalação do implante de imagem. (A) Cânula falsa. (B) Guia da cânula. (C) C C. (D) Vidro de tampa de vidro. (E)Placa de cabeça. Cânulainterna. Barra de escala: 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Ligue a máquina de solda e aqueça-a até a temperatura necessária.
   NOTA: A temperatura depende da lata de soldagem utilizada.
3. Polir a superfície lateral da cânula de imagem usando lixa fina para remover a camada de oxidação e, assim, facilitar uma solda mais forte.
4. Ajuste a posição da cânula de imagem e cânula de injeção (guia da cânula com cânula manequim inserida) utilizando mãos auxiliares(Figura 2A, B).
5. Usando uma seringa com uma agulha, aplique uma pequena quantidade de fluxo apropriado no local de conexão entre imagens e cânulas injetáveis por 5 segundos e, em seguida, remova a gota.
   NOTA: Para esta preparação, utilizamos um fluxo comercialmente disponível que é especificado pelo fabricante para soldar peças de aço inoxidável, pois as cânulas de imagem e infusão são feitas de aço inoxidável. No caso de outros materiais usados para a fabricação de cânulas, o usuário final deve selecionar fluxo que possa soldar o material selecionado.
6. Derreta a lata de solda e aplique-a no ponto de conexão tratado com fluxo(Figura 2).
   NOTA: Evite o excesso de solda, pois exigirá craniotomia maior desnecessária durante a cirurgia.

Figura 2: Esquema de montagem da cânula de injeção, consistindo de cânula guia com cânula manequim inserida, com a cânula de imagem. (A) O ângulo entre a cânula de injeção e a cânula de imagem deve ser próximo de 45 graus. (B) A ponta da cânula de injeção deve estar bem na borda da cânula de imagem. (C) Tamanho apropriado da lata de soldagem usada para imagens de solda e cânulas de injeção (linha vermelha indica o contorno da gotícula de estanho). (D) Tamanho inadequado da lata de soldagem que deve ser evitado durante a preparação do implante (linha vermelha indica o contorno da gota de estanho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Espere a lata de solda esfriar. Normalmente, leva vários segundos.
8. Confirme se a cânula de injeção não está bloqueada inserindo a cânula fictícia de ambas as direções.
9. Aplique adesivo óptico de cura UV na parte inferior da cânula de imagem usando um palito ou agulha de seringa de 26 G.
10. Use uma pinça fina para colocar cuidadosamente um copo de cobertura do tamanho correspondente à cânula de imagem.
    NOTA: O posicionamento do vidro deve ser feito precisamente na cânula de imagem sem mover muito o vidro depois de ter tocado o adesivo óptico. Caso contrário, o vidro fica sujo, reduzindo assim a qualidade da imagem.
11. Cure o adesivo por pelo menos uma hora por iluminação UV de 350-400 nm de uma lâmpada UV portátil padrão.
    NOTA: O adesivo usado deve ser opticamente transparente. Caso contrário, diminuirá a qualidade da janela de imagem.
    ATENÇÃO: Evite a exposição à pele e aos olhos usando óculos, luvas e um jaleco protetores de UV.
12. Lave a cânula em 70% de etanol, seque o ar e guarde em um recipiente estéril até a cirurgia.
    NOTA: É muito importante manter o vidro da tampa o mais limpo e intacto possível. O adesivo óptico usado é quimicamente estável em 70% de etanol.

2. Implantação de janelas

1. Etapas de preparação antes da cirurgia
   1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave.
   2. Prepare 1x PBS e 70% de etanol em duas placas de Petri separadas.
   3. Opcionalmente: Desinfete a área cirúrgica usando luz UV por pelo menos 20 minutos antes de iniciar o procedimento cirúrgico.
      NOTA: Operar sob as condições mais estéreis possíveis resultará em janelas cranianas bem sucedidas e duradouras (até 6 meses) cobertas de vidro. A contaminação pode resultar em redução da transparência da janela ou inflamação grave na maioria dos casos.
2. Procedimento cirúrgico
   1. Esterilize a área cirúrgica com 70% de etanol logo antes da cirurgia.
   2. Pesar o animal e administrar uma dose pré-cirúrgica de analgésico subcutâneamente de acordo com o protocolo animal aprovado pela IACUC.
   3. Anestesiar um rato com isoflurane (4% para indução, 1,5-2% para manutenção, 0,3-0,5 L/min de fluxo de ar). Use uma técnica de aperto de cauda e beliscão dos dedos dos dedos para garantir que o animal esteja totalmente sedado. Observe sinais vitais do animal, como respiração, SpO₂e frequência cardíaca durante a duração do procedimento.
   4. Use um aparador ou creme depilatório para remover a pele da parte de trás do pescoço até os olhos.
   5. Coloque o mouse em uma estrutura estereotaxic sobre uma almofada de aquecimento de cirurgia (mantendo 37 °C). Segure a cabeça com barras de ouvido. Empurre ligeiramente a cabeça em todas as direções para garantir que a cabeça esteja segura.
   6. Aplique pomada ocular para evitar que os olhos do animal sequem durante a cirurgia.
   7. Esterilize o local cirúrgico com betadina seguido de 70% de etanol três vezes antes de fazer uma incisão.
   8. Remova a pele sobre a parte superior do crânio, começando com um corte horizontal ao longo da base da cabeça, seguido por dois cortes na direção rostral, quase atingindo as pálpebras, em seguida, dois cortes oblíquos que convergem na linha média.
   9. Com dois cotonetes estéreis, retraia o tecido de conexão, bem como a musculatura da parte de trás do pescoço, até as bordas do crânio.
      NOTA: Tente evitar danificar os vasos sanguíneos (especialmente aqueles escondidos no músculo) durante a manipulação.
   10. Aplique uma gota de solução de lidocaína (~0,1 mL) na superfície do periósteo por 2 minutos para evitar dor excessiva. Opcionalmente para reduzir o cérebro do inchaço após a remoção do crânio, 0,1 mL de 1% de dexametasona pode ser injetado subcutâneamente.
   11. Raspe suavemente toda a área exposta do crânio com um bisturi para criar uma superfície seca e áspera que permita que a cola e o cimento dental aderam melhor e resultando em implantação crônica.
   12. Coloque a ponta da agulha montada na estação estereotaxic sobre o bregma, coloque todas as três coordenadas (AP: Anterior-Posterior; ML: Medial-Lateral; DV: Dorsal-Ventral) como 0.
   13. Coloque a ponta da agulha sobre a lambda e veja se a coordenada AP é 0 para confirmar se a posição da cabeça é vertical, bem como se a coordenada ML é 0 para confirmar que a cabeça está posicionada horizontalmente. Caso não, ajuste os botões correspondentes na estação estereotaxic, até que as coordenadas AP e ML estejam dentro de 0,1 mm.
   14. Mova a ponta da agulha para encontrar os pontos correspondentes para craniotomia e marque suas posições no crânio usando um marcador fino. No caso da implantação para hipocampo, há 4 pontos com as seguintes coordenadas (AP: -0,68, ML: -2.0) (AP: -3,68, ML: -2.0) (AP: -2.18, ML: -0.5) e (AP: -2.18, ML: -3.5)¹¹, bem como (AP: -4.0, ML: -2.0) para o ponto mais caudal da cânula de injeção.
       NOTA: O marcador utilizado nesta etapa deve ser esterilizado usando iluminação UV por pelo menos uma hora antes da cirurgia. As coordenadas aqui mostradas são para ratos C57BL/6J de 6-8 semanas de idade. As coordenadas podem diferir devido a diferentes idades ou cepas de camundongos.
   15. Desenhe um círculo baseado em quatro pontos marcados, bem como o contorno da área da cânula de injeção no lado caudal do círculo(Figura 3).

16. Use uma broca pneumática à velocidade de 10.000 rpm para suavemente "desenhar" ao longo do contorno marcado no crânio.
17. Perfurar o crânio até que uma camada muito fina de osso seja deixada, que geralmente começa a se mexer sob um toque suave no centro.
18. Aplique uma gota de PBS 1x estéril no centro da craniotomia, levante a aba óssea do crânio com fórceps de ponta muito finos ou duas agulhas de 26 G se aproximando de lados opostos.
    NOTA: O PBS ajudará a remover o pedaço do crânio e evitará possíveis sangramentos da dura¹².
19. Aplique PBS, seguido de aspiração suave através de uma agulha 26G contundente várias vezes para limpar a superfície da dura.
20. Remova suavemente a dura, seja por aspiração ou por tesoura oftálmica. Aplique sucção suave (~-60kPa) para ablatar o córtex, bem como o caloso corpus acima do hipocampo.
    NOTA: O córtex é muitas vezes mais amarelo do que o corpus calosum, e o corpus calosum é geralmente mais branco do que o hipocampo. O corpo caloso é geralmente fácil de distinguir por fibras neuronais indo nas direções vertical e horizontal quando observadas a partir da parte superior(Figura 3).

Figura 3: Coordenadas estereotaxas de localização do hipocampo e processo de ablação cerebral. (A) Quatro coordenadas para as bordas da área de craniotomia. (B) Área completa de craniotomia. (C-E) Imagens representativas adquiridas durante a cirurgia (esquerda) e seu diagrama esquemático (à direita) indicando as diferentes cores e direções das fibras neurais de (A) Córtex (B) Corpus Callosum, e(C) Hipocampo visível durante a ablação do córtex. Barra de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. O sangramento neste momento afetará a visibilidade do tecido cerebral na craniotomia. Aplique 1x PBS, seguido de sucção suave, enquanto aspira o córtex para se livrar do sangue.
   NOTA: O sangramento contínuo é inevitável durante esta etapa e, em certa medida, o sangramento contínuo é um sinal de pressão arterial normal. Ao contrário da implantação da janela de imagem do córtex, a presença de sangue sob a janela óptica é aceitável, uma vez que será limpa vários dias após a cirurgia. A inserção da cânula de imagem na cavidade criada o mais rápido possível depois de ablar o córtex é ótima.
2. Se a craniotomia for maior em <0,5 mm do que a cânula de imagem, resgate a instalação da cânula até certo ponto usando vedação extra do Kwik Sil antes de fixar o implante com SuperBond.
3. Se a craniotomia for menor em <0,5 mm do que a cânula de imagem, resgate o procedimento cirúrgico até certo ponto, aparando a borda da craniotomia usando uma pinça fina ou um par de tesouras oftálmicas, uma vez que o osso restante na borda da craniotomia é mais fino que o próprio crânio como resultado da perfuração.
   NOTA: Craniotomias que excedem as faixas acima de 0,5 mm não podem ser resgatadas. As ações correspondentes nesses casos devem seguir o procedimento de rescisão de acordo com o protocolo animal.

21. Insira suavemente o implante na craniotomia.
22. Pressione firmemente em cima do implante com a agulha em forma de L para posicionar a janela óptica do implante o mais perto possível da superfície exposta do hipocampo. Aplique repetidamente PBS no crânio ao redor do implante seguido de sucção para remover o sangue o máximo possível durante a inserção do implante. Em seguida, aplique uma fina camada de Kwik Sil entre o implante e o crânio para evitar que o cimento dental penetre sob o crânio(Figura 4).
    1. Certifique-se de que a colocação da janela óptica do implante está bem contra o hipocampo para evitar o sangue ou outro acúmulo de líquido por baixo.
       NOTA: O ponto crítico é garantir que o vidro de cobertura da cânula de imagem seja colocado apenas contra o hipocampo, o que pode exigir pressão suave em cima da cânula durante o processo de instalação e vedação. Se o lado superior da cânula de imagem é paralelo ao crânio não é crítico para o acesso óptico final, desde que a janela óptica seja colocada contra o hipocampo.
    2. De acordo com a espessura média do córtex acima da área ca1, mantenha a superfície superior da cânula de imagem acima da superfície do crânio em ~0,5 mm para facilitar a fixação da cânula ao crânio(Figura 4).
23. Uma vez que o Kwik Sil é curado, que geralmente não leva mais do que ~1 min, aplique Super-Bond C&B uniformemente na superfície do crânio, na superfície de Kwik-Sil, e na superfície superior do implante.
24. Uma vez que o Super-Bond C&B esteja curado, aplique resina de base dentadura acima do Super-Bond C&B, bem como a pele em torno da incisão feita no início da cirurgia.
    NOTA: Tipos alternativos de cimento estão disponíveis em vários fornecedores. Siga as instruções do fabricante correspondente.
25. Depois que a resina da base de dentadura for curada, coloque a placa da cabeça sobre a resina ao redor do implante e torne-a concêntrica com a cânula de imagem. Aplique mais resina de base de dentadura ao redor e acima da placa da cabeça para corrigir sua posição. Deixe curar por vários minutos.
    1. Evite construir uma camada espessa de cimento ao redor da cânula para garantir melhor acesso à janela de imagem com a lente objetiva(Figura 4).

Figura 4: Diagrama esquemático da implantação da janela na (A) coronal e (B) visão sagital. (a)Placa de cabeça; bResina de base de dentadura; (c) Superbond; dKwik-Sil; (e) Cânula de imagem; (f) Cânula de injeção; (g) Lata de solda. (C): Mouse com o implante instalado após a cirurgia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Diluir a resina da base de dentadura para diminuir sua viscosidade, permitindo assim que ela preencha as ressalvas que são difíceis de alcançar com um aplicador.

26. Coloque delicadamente uma fita de borracha isolada acima da janela para proteger a janela de uma possível contaminação da cama animal.
27. Quando a cirurgia terminar, injete a droga anti-inflamatória subcutânea para evitar uma resposta inflamatória.
28. Coloque o animal em uma gaiola quente até que ele se recupere da anestesia.
29. Verifique o estado de saúde do camundongo para 72 h após a cirurgia observando o comportamento geral. Anti-inflamatórios e analgésicos são injetados subcutâneamente por dois ou três dias após a cirurgia a cada 24 horas para liberar dor e reduzir a resposta inflamatória.
    NOTA: Procedimentos alternativos de monitoramento, medicamentos e dosagens são possíveis para o cuidado pós-operatório, consulte o protocolo animal aprovado pelo IUCAC para o procedimento exato.
30. Verifique a janela 5-7 dias após a cirurgia para observar vasculatura sob a janela. No caso de uma janela clara, o animal está pronto para injeção de vírus.

3. Injeção de vírus

NOTA: A injeção de vírus geralmente é feita em 5-7 dias após a cirurgia. Antes da injeção do vírus, é preciso confirmar que a janela de imagem é clara, e é possível observar vasculatura cerebral(Figura 5). Em alguns casos, pode levar até 14-16 dias para limpar a janela, o que também é aceitável se nenhuma inflamação cerebral for detectada.

Figura 5: Imagem representativa da janela óptica (A) antes e (B) após injeção de vírus suplementada com corante FastGreen. A seta indica a mesma estrutura de vasculatura. Barra de escala: 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Adicione solução de estoque de corante verde-rápido à solução de vírus, diluída ao titer desejado, na proporção de 1:9 em um tubo PCR.
   NOTA: O corante verde rápido é adicionado para facilitar a visualização da solução do vírus durante a injeção.
2. Conecte a tubulação de polietileno com a seringa e ensine novamente a tubulação com óleo mineral usando uma bomba de seringa.
3. Conecte a cânula interna à outra extremidade da tubulação, infundir e retirar o óleo mineral algumas vezes para garantir que a cânula interna não esteja entupida.
4. Anestesiar o animal com isoflurane (4% para indução, 1,5-2% para manutenção, 0,3-0,5 L/min de fluxo de ar), fixar a cabeça em uma estrutura estereotaxic sobre uma almofada de aquecimento (mantendo 37 °C), aplicar pomada ocular.
5. Retire 600 nL da solução do vírus, remova a cânula falsa e insira a cânula interna conectada à seringa de injeção na cânula guia, infundir o vírus na velocidade de 50 nL/min por 10 minutos no total.
   NOTA: Verifique se o corante é visível através da janela usando um estereótipo para confirmar a injeção bem sucedida do vírus(Figura 5).
6. Após a injeção, mantenha a cânula interna conectada por 10 minutos para permitir que o vírus se espalhe sob a janela.
7. Remova suavemente a cânula interna da cânula guia e recapitule-a com uma cânula falsa.
8. Coloque o animal em uma gaiola quente até que ele se recupere da anestesia.
   NOTA: Normalmente, os camundongos estão prontos para a imagem em 10-20 dias após a injeção viral. O nível de expressão e o tempo dependem do sorotipo e promotor do vírus usados para impulsionar a expressão genética.

4. Imagem de ratos acordados sob microscópio de campo largo.

NOTA: A placa de cabeça preparada proporciona uma estabilidade extraordinária do implante de imagem e, portanto, permite imagens longitudinais em camundongos acordados e comportando-se com artefatos de movimento mínimo.

1. Induzir o mouse com 4% de isoflurane por alguns minutos, fixar sua placa de cabeça no garfo da cabeça e, em seguida, fixar o garfo da cabeça na esteira.
   NOTA: O garfo da cabeça e a esteira são personalizados para a placa de cabeça usada neste estudo, consulte Materiais de Suporte para os arquivos cad correspondentes. A indução do camundongo antes da fixação da cabeça é opcional, pois é possível habituar animais para este procedimento.
2. Mova a esteira sob o estágio do microscópio e posicione a janela óptica sob lente objetiva.
3. Use uma lente objetiva de baixa ampliação para encontrar o melhor campo de visão (FOV) para imagem funcional e, em seguida, mude para uma lente objetiva na mais alta para registrar as atividades neuronais na resolução unicelular.
   NOTA: Se a cânula de injeção ainda for um obstáculo para que a lente objetiva atinja sua distância de trabalho, use um cortador de arame para cortar a cânula de injeção da placa da cabeça.

Resultados

Imagem in vivo da atividade neuronal usando um indicador de cálcio geneticamente codificado. Em média, a imagem in vivo começa de 3 a 4 semanas após a implantação se um nível suficiente de expressão transgênica for alcançado. A essa altura, edema cerebral e hemorragia geralmente são completamente resolvidos, e a vasculatura cerebral pode ser facilmente observada através da janela óptica. Aqui utilizamos a preparação descrita para realizar as repetidas gravações de atividade neuronal na região do CA1 hipocampal dorsal no comportamento de camundongos sob microscópio de campo largo fluorescência. Para registrar a atividade neuronal, utilizamos um indicador de cálcio geneticamente codificado brilhante, chamado NCaMP7¹³, que apresenta sensibilidade de cálcio semelhante e resolução temporal à de GCaMP6s¹⁴. Para expressar o indicador NCaMP7 no hipocampo, injetamos o vírus rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 usando uma cânula de infusão e iniciamos imagens longitude aos 14 dias após a injeção. Para registrar a atividade neuronal, utilizamos uma lente objetiva de ar 10x NA 0.3 e a câmera sCMOS da Hamamatsu OrcaFusion que permitia imagens a ~1,5x1,5 mm FOV em até 100 Hz de frequência. A fluorescência verde estava entusiasmada com um LED de 470 nm comercialmente disponível usando um conjunto de filtro gfp padrão. A profundidade média de imagem alcançada no canal verde é de cerca de 50-120 μm, o que permite o registro da atividade neuronal principalmente em estrato oriens e estrato pyramidale. A profundidade de imagem em canais infravermelhos próximos pode ser de até 200 μm atingindo as camadas mais profundas do hipocampo⁸. O tempo médio de gravação por FOV foi de 6 a 12 minutos, embora sessões de imagem muito mais longas sejam possíveis, pois o NCaMP7 é caracterizado por uma fotoesestabilidade extremamente alta e não foi observada fototoxicidade detectável(Figura 6).

Figura 6: Registro da atividade neuronal nos neurônios hipocampais usando um indicador de cálcio geneticamente codificado por fluorescência verde. (A) Um FOV selecionado imagem sob um microscópio de fluorescência de campo largo no canal verde. (B) Os 15 ROIs correspondentes aos neurônios únicos mostrados em A e selecionados utilizando-se a projeção de desvio padrão de toda a gravação. (C) Fluorescência representativa traços de ensaio único dos 15 neurônios selecionados em B. (D) Uma visão de zoom representativa de 2 traços de cálcio mostrados em caixas de cor correspondentes mostradas na barra C. Escala, 100 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para obter traços de fluorescência, as regiões de interesse (ROIs) correspondentes às somas neuronais foram segmentadas manualmente e analisadas pelo software ImageJ. Antes da correção do movimento de análise de imagens, não eram necessários procedimentos comuns pós-registro em animais acordados, pois os conjuntos de dados adquiridos não apresentavam artefatos de movimento devido à alta estabilidade do implante de imagem. Um registro óptico representativo de atividades neuronais do hipocampo em um rato comportado acordado é apresentado na Figura 6. 15 ROIs correspondentes às somas neuronais foram selecionados manualmente do mesmo FOV mostrado na Figura 6B, e os traços de fluorescência de ensaio único dentro de cada ROI são mostrados na Figura 6C. A Figura 6D mostra duas partes representativas de traços de fluorescência de dois ROIs diferentes. Foram realizadas 4 sessões consecutivas de imagem para o mesmo FOV com intervalos de 3 dias. Foi possível identificar e imaginar os mesmos neurônios em certos FOVs por pelo menos duas semanas (as sessões de imagem mais longas não foram realizadas para este estudo, no entanto, a mesma preparação tem sido usada para até 6 meses de estudo de imagem em camundongos anteriormente⁷; Figura 7). Neste estudo, utilizamos vetor AAV/DJ-CAG, que conduzia uma forte expressão do gene de interesse mesmo 21 dias após a entrega do vírus(Figura Suplementar 1). A expressão contínua complicou a identificação a longo prazo dos mesmos neurônios devido ao aumento do histórico de fluorescência e aparência de novos neurônios expressando o indicador de cálcio. Portanto, a seleção do sorotipo AAV e do promotor para conduzir a expressão genética alvo deve ser uma das considerações importantes durante o design experimental, em particular se a imagem longitudinal do mesmo subconjunto de neurônios for necessária. A qualidade da imagem permitiu resolver dendritos proximais, bem como visualizar vasos sanguíneos.

Figura 7: Sequência de imagem de quatro FOVs diferentes da área hipocampal rastreada ao longo de 12 dias. O animal foi implantado com a janela no dia 0 e foi injetado com o vírus rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 no dia 7. Pontas de flecha indicam o neurônio rastreado dentro do FOV. Barras de escala: 80 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagem in vivo de atividade neuronal usando um sensor de tensão geneticamente codificado.
Neste estudo, também utilizou-se um novo sensor de tensão geneticamente codificado, chamado SomArchon^7,que permite a imagem de tensão com resolução de um único pico de células em animais de comportamento^7,8. Para expressar o SomArchon, injetamos o vírus rAAV/DJ-CAG-SomArchon usando uma cânula de infusão e realizamos imagens de tensão em um rato de comportamento fixo na cabeça vários dias após a injeção. Para registrar a atividade neuronal, utilizamos uma lente objetiva 40x NA 0.8 e uma câmera sCMOS de Hamamatsu OrcaFusion que nos permitiu a imagem de 150x40 μm FOV a uma taxa de aquisição de até 830 Hz. A proteína GFP, que uma parte da SomArchon constrói para facilitar a visualização da expressão na faixa visível do espectro, pode ser facilmente visualizada no canal verde (excitação led a 470/20 nm, emissão de 525/50 nm) para localizar células de interesse para imagens de tensão. Foram realizadas gravações de tensão óptica no canal infravermelho próximo (excitação a laser de 637 nm a 3,4 W/mm², emissão de 665 nm de passagem longa) com binning de 4 x 4 a 830 Hz de taxa de aquisição. Registramos a atividade espontânea de um neurônio hipocampal em um camundongo acordado com SNR médio de 7 por potencial de ação(Figura 8).

Figura 8: Registro da atividade neuronal nos neurônios hipocampais usando um indicador de fluorescência infravermelha quase infravermelha geneticamente codificada SomArchon. (A) Um FOV selecionado imagem sob microscópio de fluorescência de campo largo no canal quase infravermelho. (B) Traço de fluorescência de ensaio único do neurônio em A. (C) Uma visão de zoom representativa do traço de tensão na caixa correspondente mostrada em B. Barra de escala: 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

histologia
Após o estudo de imagem funcional, a análise pós-morte é usada para confirmar a correta colocação do implante, a área de expressão do vírus e a localização de uma proteína de interesse em neurônios imaged. Para verificação histológica da expressão do vírus e colocação do implante, seções coronais do cérebro fixo pfa foram examinadas sob um microscópio de campo largo fluorescência(Figura 9A, C). Um microscópio confocal foi utilizado para adquirir imagens de alta resolução de neurônios individuais expressando o indicador de cálcio, bem como o indicador de tensão (Figura 9B, D). A coloração da DAPI foi usada para visualizar a morfologia geral da fatia cerebral. Além disso, as fatias cerebrais podem ser avaliadas usando imunohistoquímica para verificar astrogliose ou gliose causada pela implantação da janela e expressão viral. Nossos estudos anteriores demonstraram que o procedimento não induzia gliose perceptível⁷.

Figura 9: Verificação histológica da posição da janela óptica e expressão do vírus. (A) Uma imagem fluorescente representativa da fatia cerebral da seção coronal mostrando a colocação da janela óptica de um mouse expresso em NCaMP. Barra de escala: 1 mm. (B) Uma imagem confocal representativa dos neurônios expressando os indicadores NCaMP7. Barra de escala: 25 μm. (C) Uma imagem representativa da fluorescência da fatia cerebral da seção coronal mostrando a colocação da janela óptica de um rato expresso da SomArchon. Barra de escala: 1 mm. (D) Uma imagem confocal representativa dos neurônios expressando os indicadores SomArchon. Barra de escala: 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Análise quantitiva da intensidade relativa da fluorescência juntamente com o tempo de expressão. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussão

Aqui descrevemos um método para imagens de longo prazo da região do hipocampo CA1 no comportamento de camundongos. O método baseia-se na implantação crônica de uma janela de imagem personalizada, que também permite a administração direcionada de vírus ou drogas diretamente aos neurônios de interesse. O presente protocolo consiste em quatro partes principais: i) montagem de implante de imagem; ii) instalação de implante de imagem; iii) injeção de vírus por meio de implante de imagem; iv) imagem funcional em camundongos comportadores. Abaixo descrevemos e discutimos etapas críticas no protocolo, solução de problemas, modificações e limitações do método. Também discutimos a importância do método e suas potenciais aplicações alternativas.

Existem várias etapas críticas no protocolo descrito que são bastante importantes para uma cirurgia bem sucedida: (i) preparação de um implante de imagem de alta qualidade; (ii) condições cirúrgicas estéreis; (iii) aspiração do córtex; (iv) colocação precisa do implante de imagem; v Injeção viral. Como o passo 1.6 indica, o excesso de solda de lata exigiria uma craniotomia maior e, assim, aumenta o risco de inflamação. Também é muito importante usar uma quantidade adequada da cola óptica adesiva ao fixar o vidro de cobertura na cânula de imagem, como indicado na Etapa 1.11, pois uma quantidade insuficiente pode resultar em vazamento de fluido cefalorraquidiano na cânula de imagem e tornando-o opaco. Por outro lado, o excesso de adesivo óptico pode resultar na diminuição da transparência da janela de vidro. Uma possível contaminação do implante de imagem pode causar uma proliferação ativa do tecido conjuntivo sob a janela óptica e/ou inflamação grave, o que levará ao término precoce do experimento. Portanto, a montagem e preparação do implante de imagem antes da cirurgia é quase tão importante quanto o procedimento cirúrgico em si.

Durante a cirurgia, a parte do córtex sob craniotomia é ablada pela aspiração suave, o que resulta em sangramento inevitável. O sangue no local cirúrgico reduz significativamente a visibilidade do tecido cerebral que deve ser removido. Isso complica a avaliação precisa da profundidade necessária da ablação tecidual. A descarga cuidadosa do local cirúrgico com PBS toda vez antes de aplicar sucção para remover a próxima porção de tecido proporciona um melhor controle da profundidade. O tecido cerebral deve ser sempre removido em pequenas porções passo a passo confirmando a profundidade do tecido ablado antes de prosseguir com mais sucção. Um controle mais fino da sucção também pode ser alcançado com uma agulha sem corte mais fina. Sugerimos o uso de uma agulha de 26 G, no entanto, diâmetro menor que 26 G é mais propenso a entupimento. Além disso, geralmente é preciso muita prática para determinar a profundidade precisa da aspiração necessária para cada animal, já que a cor do córtex, corpus calosum e hipocampo pode variar de rato para rato(Figura 3).

A inserção e a fixação do implante de imagem devem ser feitas com muita precisão para garantir a posição mais próxima possível da janela de imagem à superfície dorsal do hipocampo. O tamanho da craniotomia preparada deve coincidir com o implante e permitir sua inserção sem resistência significativa. Ao mesmo tempo, não deve haver uma lacuna visível entre o crânio e o implante para garantir a vedação adequada e evitar a exposição ao tecido cerebral. A pressão suave e estável deve ser aplicada na parte superior do implante durante a vedação do crânio. É quase inevitável ter sangue sob a janela de imagem durante a instalação do implante. Se o procedimento cirúrgico for feito corretamente, a janela deve sair em 3-7 dias, e a vasculatura cerebral torna-se claramente visível. Também é importante garantir que o vírus seja injetado corretamente sob a janela. No caso de expressão falha, o vírus pode ser reinjetado várias vezes.

A maior complicação que encontramos em alguns casos é a visibilidade reduzida da janela de imagem. Existem várias razões possíveis para a má qualidade da imagem: i) inflamação contínua; ii) crescimento do tecido conjuntivo no vidro; iii) grande lacuna entre a janela e o hipocampo. A inflamação geralmente é causada por contaminação durante a cirurgia ou por implante de imagem não devidamente esterilizado. Sugerimos autoclavar os instrumentos cirúrgicos antes e depois de cada cirurgia, desinfetar a área cirúrgica logo antes do procedimento e usar equipamentos de proteção pessoal limpos durante a cirurgia. Os implantes de imagem devem ser limpos após a montagem, esterilizados e armazenados em condições estéreis. O crescimento do tecido conjuntivo no vidro do implante de imagem pode ser devido à contaminação mecânica na superfície do vidro ou ao trauma excessivo do tecido cerebral durante a ablação do córtex. Após a montagem do implante, é importante confirmar que a superfície do vidro está limpa e lisa. Além disso, todos os pedaços de tecido cerebral danificado devem ser cuidadosamente removidos antes de inserir implante de imagem na craniotomia. Em certos casos, a distância entre a janela de vidro e o hipocampo resulta no acúmulo de fluido cefalorraquidiano, reduzindo a qualidade da imagem. Portanto, durante a instalação do implante, é crucial inseri-lo até o fim para garantir um bom contato entre hipocampo e janela de vidro. Às vezes, é difícil identificar a razão exata da janela de imagem opaca. Sugerimos a realização de análises post-mortem para revelar condições sob a janela óptica e ajustar correspondentemente cirurgias subsequentes.

O método possui diversas limitações fundamentais e técnicas que devem ser levadas em conta antes e durante a imagem in vivo. Uma das principais limitações é a ablação do córtex. Parte do córtex visual e sensorial é removida durante a cirurgia. Embora seja difícil avaliar precisamente o impacto da ablação do córtex, uma vez que o tecido cerebral removido não se projeta diretamente no hipocampo, vários estudos não demonstraram prejuízo perceptível da aprendizagem dependente do hipocampo ou de outras funções relevantes do hipocampo^15,16. As limitações ópticas também devem ser consideradas, especialmente quando são usadas lentes objetivas na altas. Por exemplo, neste estudo, utilizamos uma cânula de 1,75 mm de comprimento com diâmetro interno de 1,9 mm. A geometria desta cânula não preservará o objetivo de ar completo com NA mais de ~0,5 ou objetivo de água com NA mais de ~0,6, pois cortará um pouco de luz. Outra limitação, comum para todos os implantes de imagem cerebral, é que parte do cérebro está sendo exposta, promovendo assim perda de calor^17,18. No entanto, a temperatura fisiológica do cérebro pode ser facilmente restaurada durante a imagem por perfusão de um tampão quente.

O método descrito pode ser facilmente modificado ou ajustado para outras aplicações. Por exemplo, a preparação pode ser adaptada para imagem do estriato⁷. Como o estriado está ligeiramente mais profundo que o hipocampo, a cânula de imagem mais longa deve ser usada para a montagem do implante de imagem. Sugerimos usar cânula de imagem de 2,0 mm. As coordenadas da craniotomia devem ser ajustadas correspondentemente (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Além disso, a injeção de vírus via cânula de infusão permite alcançar a expressão de um transgênico em uma fina camada de neurônios ao usar sorotipo AAV com propagação restrita^19,20. É particularmente benéfico para a imagem de um fóton devido à redução da fluorescência fora do foco de camadas mais profundas e, como resultado, melhorou a imagem de resolução unicelular. Além disso, a cânula de injeção também pode ser usada durante a imagem funcional para a administração de medicamentos ou outros produtos químicos diretamente nos neurônios em FOV (Figura 5B). A cânula de infusão geral adiciona funcionalidades úteis ao implante de imagem, melhorando a qualidade da imagem devido à expressão viral direcionada e permitindo a estimulação farmacológica dos neurônios em FOV. A placa de cabeça usada proporciona uma estabilidade extraordinária do implante de imagem minimizando artefatos de movimento mesmo em animais em movimento ativo em uma esteira. A placa da cabeça é pequena e leve, causando um mínimo de desconforto aos animais, e permanece estável por vários meses após a instalação. O implante de imagem também é compatível com imagens multifotonas^15,16,21 e pode ser combinado com micro-endoscópios^22,23. Um implante de imagem semelhante também foi utilizado para imagens multifotonas das estruturas mais profundas do hipocampo, incluindo radiador de estrato, lacunose estrato e giro dentado^{16,24,25,26,27}. No entanto, direcionar as estruturas mais profundas do hipocampo com AAVs via cânula de infusão pode exigir maior otimização do sorotipo AAV e volume¹⁹.

Acreditamos que o protocolo descrito facilitará estudos que visam investigar a atividade neuronal com alta resolução espacial no hipocampo de comportamento de camundongos usando configurações simples e acessíveis de imagem de um fóton.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover glass	Deckgläser	72296-03
Denture Base Resin	ShangHai New Centery Dentel Material	N/A	Type I, self-solidifying
Dummy Cannula	RWD Life Science Co.,LTD	62102	OD 0.30mm
Guide Cannula	RWD Life Science Co.,LTD	62003	26G
Head Fork	N/A	N/A	Custom made
Head Plate	N/A	N/A	Custom made
Imaging Cannula	N/A	N/A	Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel
Internal Cannula	RWD Life Science Co.,LTD	62203	0.30*0.14 (OD*ID, mm)
Kwik Sil	World Precision Instruments	KWIK-SIL
SuperBond C&B	SUN MEDICAL	N/A	SuperBond C&B kit
Treadmill Kit	N/A	N/A	Custom made
UV-cured Adhesive	NORLAND PRODUCTS	NOA 60