Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Resumo

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Resumo

Os neutrófilos funcionam como a primeira linha de defesa celular em uma resposta imune inata, empregando diversos mecanismos, como a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Este estudo analisa as alterações morfológicas e composicionais em TNEs induzidas por estímulos microbianos e químicos utilizando metodologias padronizadas in vitro para indução e caracterização da TNE com células humanas. Os procedimentos aqui descritos permitem a análise da morfologia da NET (lítica ou não lítica) e da composição (estruturas DNA-proteína e atividade enzimática), e o efeito de fatores solúveis ou contato celular sobre tais características. Além disso, as técnicas aqui descritas poderiam ser modificadas para avaliar o efeito de fatores solúveis exógenos ou de contato celular na composição da TNE.

As técnicas aplicadas incluem a purificação de células polimorfonucleares do sangue periférico humano usando um gradiente de densidade dupla (1,079-1,098 g/mL), garantindo pureza e viabilidade ideais (≥ 95%), conforme demonstrado pela coloração de Wright, exclusão de azul de tripano e citometria de fluxo, incluindo análise FSC versus SSC e coloração 7AAD. A formação de NET é induzida com estímulos microbianos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans) e químicos (acetato de miristato de phorbol, HOCl), e os TNEs são caracterizados por coloração DNA-DAPI, imunocoloração para o peptídeo antimicrobiano catelicidina (LL37) e quantificação da atividade enzimática (elastase de neutrófilos, catepsina G e mieloperoxidase). As imagens são adquiridas por microscopia de fluorescência e analisadas com ImageJ.

Introdução

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na corrente sanguínea, desempenhando um papel essencial durante a depuração de agentes patogênicos por diversos mecanismos, incluindo a liberação de grandes estruturas cromatina compostas de DNA e várias proteínas antibacterianas nucleares, citoplasmáticas e granulares ^1,2. O antecedente direto descrevendo esse papel antimicrobiano dos neutrófilos foi feito por Takei et ^al.3 em 1996. Esses autores relataram uma nova forma de morte diferente da apoptose e necroptose em neutrófilos, mostraram alterações morfológicas exibindo ruptura nuclear, seguidas de derramamento do nucleoplasma para o citoplasma, e um aumento na permeabilidade da membrana a partir de 3 h de incubação com acetato de miristato de forbol (PMA)^2,3. No entanto, foi somente em 2004 que o termo "armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs)" foi utilizado⁴.

A formação de NET tem sido observada em diversas condições, como infecções bacterianas, fúngicas⁵, virais⁶ e parasitárias, para neutralizar, matar e prevenir a disseminação microbiana⁷. Outros estudos mostram que também pode ocorrer em condições não patogênicas por estímulos estéreis, como citocinas, ácido úrico monossódico ou cristais de colesterol, autoanticorpos, imunocomplexos e plaquetas ativadas⁷. Lipopolissacarídeo (LPS), interleucina-8 (IL-8) e PMA estavam entre os primeiros estímulos in vitro descritos como indutores de NET, e o envolvimento in vivo da TNE em processos patogênicos foi demonstrado em dois modelos de inflamação aguda: disenteria experimental e apendicite humana espontânea⁴. O DNA é um componente essencial da NET. Sua estrutura e composição adequadas são necessárias para o sequestro e morte de microrganismos, fornecendo uma alta concentração local de moléculas antimicrobianas em direção aos micróbios capturados, como demonstrado por um breve tratamento com desoxirribonuclease (DNase) que desintegra TNEs e suas propriedades microbicidas4. Além do DNA, os TNEs compreendem proteínas aderentes, como histonas, elastase de neutrófilos (NE), catepsina G (GC), proteinase 3, lactoferrina, gelatinase, mieloperoxidase (MPO) e peptídeos antimicrobianos (AMPs), como o peptídeo pró-inflamatório catiônico catelicidina LL-37, entre outros ^8,9. Tais agregados podem formar roscas maiores com diâmetros de até 50 nm. Esses fatores podem perturbar os fatores de virulência microbiana ou a integridade da membrana celular do patógeno; além disso, os AMPs podem estabilizar o DNA derivado da TNE contra a degradação por nucleases bacterianas¹⁰.

Os mecanismos específicos que regulam a formação da NET ainda não foram completamente esclarecidos. A via mais bem caracterizada que leva à liberação de NET é através da sinalização ERK, que leva à ativação da NADPH oxidase e à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), bem como ao aumento do cálcio intracelular que desencadeia a ativação da via MPO. Este, por sua vez, transforma o peróxido de hidrogênio em ácido hipocloroso, ativando o NE por oxidação^11,12. O NE é responsável por degradar os filamentos de actina do citoesqueleto para bloquear a fagocitose e translocá-los para o núcleo para processamento por clivagem proteolítica e desaminação por PAD4 que impulsionam a dessensibilização das fibras cromatinas, que se associam a proteínas granulográficas e citoplasmáticas, e são então liberadas extracelularmente⁷. Essas proteases incluem aquelas liberadas do complexo azurossomo dos grânulos azurófilos e outras proteases, como a catepsina G¹³.

Dependendo das alterações morfológicas nos neutrófilos, os TNEs são classificados em dois tipos: formação de TNE suicida ou lítica levando à morte celular⁴ e formação de TNE vital ou não lítica produzida por células viáveis mediadas por uma liberação vesicular de DNA nuclear ou mitocondrial, com remanescente de citoplasto anucleado com capacidade fagocítica^14,15. Geralmente, TNEs compostos de DNA mitocondrial apresentam morfologia de fibra alongada¹⁴, enquanto aqueles estruturados de DNA nuclear têm aparência de nuvem³. No entanto, não se sabe como o neutrófilo escolhe sua origem no DNA. Ao contrário de estudos anteriores que descreveram as vias canônicas dos TNEs como exigindo várias horas, a via vital é rapidamente ativada em apenas 5-60 min¹⁵.

Apesar desses avanços, a composição da TNE varia de acordo com o estímulo; por exemplo, diferentes cepas mucoides e não mucoides de P. aeruginosa induzem a formação de TNEs contendo 33 proteínas comuns e até 50 proteínas variáveis⁷. Assim, faz-se necessário homogeneizar técnicas que permitam a geração de conclusões objetivas em grupos de pesquisa. Este trabalho descreve um protocolo com várias técnicas que permitem comparar e avaliar a composição, estrutura e morfologia de TNEs induzidos com diferentes microrganismos: Staphylococcus aureus (bactéria gram-positiva), Pseudomonas aeruginosa (bactéria gram-negativa) e Candida albicans (fungo), bem como estímulos químicos (PMA, HOCl) em neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis. Os resultados representativos demonstram a heterogeneidade dos TNEs dependendo de seu estímulo indutor em condições in vitro comparáveis, caracterizadas por coloração DNA-DAPI, imunocoloração para LL37 e quantificação da atividade enzimática (NE, GC e MPO).

Protocolo

As amostras de sangue foram obtidas como doações de participantes clinicamente saudáveis após consentimento informado. Todos os experimentos foram realizados com a permissão do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Faculdade de Ciências Bioquímicas da Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca.

NOTA: Os critérios de inclusão no estudo foram sexo e idade indistintos e clinicamente saudáveis de acordo com as respostas dos participantes a um questionário antes de uma amostra de sangue. Uma análise hematológica foi realizada para determinar a contagem de células e descartar infecções ou anemia, bem como o teste de proteína C-reativa para descartar inflamação no doador.

1. Coleta de sangue periférico e obtenção da embalagem de eritrócitos e leucócitos

1. Coletar 10 mL de sangue periférico por punção venosa em tubos com 1,8 mg/mL de K_2· EDTA como anticoagulante (ver Tabela de Materiais) de indivíduos clinicamente saudáveis após a obtenção do consentimento informado. Em seguida, realize a biometria sanguínea padrão e o teste de proteína C-reativa para descartar infecção ou inflamação, garantindo a qualidade da amostra.
2. Centrifugar a amostra de sangue periférico a 82 x g durante 15 min para remover o plasma rico em plaquetas, seguido de uma segunda centrifugação a 630 x g durante 5 min. Descarte o plasma restante para obter a embalagem de eritrócitos e leucócitos.
3. Diluí-lo na proporção de 1:1 (v/v) com 1x solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco.

2. Purificação de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) usando um gradiente de dupla densidade

NOTA: Realizar a purificação de neutrófilos imediatamente após a coleta do sangue, porque eles têm uma vida útil in vitro limitada de cerca de 8 h.

1. Depositar o seguinte num tubo de vidro estéril de 10 ml (ver Tabela de Materiais) por ordem: 1 ml de solução de densidade de 1,098 g/ml, 1 ml de solução de densidade de 1,079 g/ml (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, 4 ml da embalagem diluída de eritrócitos e leucócitos. Despeje sobre as paredes sem quebrar a tensão superficial entre as camadas para evitar que elas se misturem.
2. Centrífuga a 320 x g durante 20 min a 4 °C, evitando a aceleração/desaceleração de modo a que as altas forças da centrífuga não perturbem o gradiente.
3. Aspirar a fase que corresponde aos granulócitos (Figura 1A) por pipetagem e transferir para outro tubo de vidro estéril de 10 mL. Lavar com 4 ml de 1x DPBS a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
4. Descarte o sobrenadante e trate as células com choque osmótico para remover os eritrócitos restantes. Adicionar 4 mL de solução salina a 0,2% por 2 min a 4 °C e centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione 4 mL da solução isotônica (solução salina a 0,65%) por 5 min a 4 °C para restaurar a integridade da membrana e centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C.
   NOTA: A solução salina a 0,2% é um meio hipotônico, com menor concentração de soluto em relação à do meio intracelular eritrocitária. O contato com o meio hipotônico permite que a água se difunda no eritrócito, levando ao seu inchaço e hemólise. Esta remoção de hemácias do sobrenadante foi confirmada por observação microscópica.
5. Remova o sobrenadante. Ressuspeite as células em 4 mL de 1x DPBS para remover detritos celulares e, em seguida, centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C. Finalmente, ressuspenda o pellet celular em 2 mL de tampão de solução salina balanceada de Hank (HBSS) frio.

3. Morfologia e viabilidade dos neutrófilos (Figura 1B)

1. Teste de exclusão azul de tripano
   1. Diluir 5 μL da suspensão celular em 20 μL de azul de tripano a 0,4% (proporção de 1:5). Conte as células em uma câmara de Neubauer e determine a viabilidade celular usando um teste de exclusão. Considere as células que mantêm a integridade de sua membrana sem permeabilizar o corante como viáveis.
   2. Montagem de 5 μL da suspensão celular numa lâmina; seco e manchado com a mancha de Wright por 15 s. Fixar imediatamente a amostra com tampão fosfato pH 6,4 durante 30 s. Lave com água destilada suficiente e observe a morfologia sob um microscópio óptico (100x).
2. Análise de coloração 7AAD e citometria de fluxo
   1. Adicione 1 x 10⁵ células aos tubos de citometria de fluxo e core com 1 μL de 7AAD em 100 μL de tampão FACS (1x DPBS, azida de sódio a 0,1% e plasma descomplementado autólogo a 10%) por 15 min a 4 °C no escuro.
   2. Lavar com 500 μL de tampão FACS a 300 x g durante 10 min. Fixar as células com 500 μL de paraformaldeído a 2% e armazenar a 4 °C até à sua análise no citómetro de fluxo.
   3. Para um controle de células mortas, fixar 1 x 10⁵ células com 200 μL de paraformaldeído a 4% por 30 min e lavar com 500 μL de 1x PBS a 300 x g por 10 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e descarregue. Em seguida, adicione 200 μL de Triton X-100 a 0,1% por 1 h a 4 °C. Lave com 500 μL de 1x PBS e deixe com 7AAD como na etapa 3.2.1.
   4. Usando um citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais), realize a análise FSC versus SSC para analisar a pureza celular e a coloração SSC versus 7AAD para analisar a viabilidade celular. Leia 3 x 10⁴ eventos em 100 μL de volume de absorção em fluxo médio (1.000 células/s) nas configurações polimorfonucleares (FSC, 400-490 e SSC, 300-320).
   5. Analisar os dados capturados no software do citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais) e determinar a porcentagem de pureza e células positivas para 7DAA na população polimorfonuclear, apresentada através de gráficos de pontos e histogramas.

4. Coloração CFSE de microrganismos

1. Adicionar 1 x 10⁸ bactérias ou 1 x 10⁶ pseudo-hifas fúngicas em microtubos de 1,5 mL e corar com 200 μL de 5 μM de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) dissolvido em 1x PBS. Misturar durante alguns segundos e incubar a 37 °C durante 10 minutos no escuro.
2. Pare a reação adicionando 500 μL de plasma descomplementado e centrifugar a 620 x g por 10 min para pseudo-hifas ou a 1.800 x g por 10 min para bactérias.
3. Rejeitar os sobrenadantes e lavar os pellets com 1 ml de 1x PBS com centrifugação como no passo 4.2. Finalmente, ressuspenda os microrganismos em 250 μL de 1x PBS.
4. Preparar alíquotas de 50 μL em microtubos de 1,5 mL com 2 x 10⁷ bactérias (MOI: 100) ou 2 x 10⁵ pseudo-hifas (MOI:1) para indução NET.

5. Indução NET

1. Coloque as tampas de vidro estéril de 10 mm x 10 mm em uma placa de 24 poços e cubra com 10 μL de poli-L-lisina a 0,001% por 1 h à temperatura ambiente. Lave duas vezes com 100 μL de 1x PBS, seque ao ar e irradie com luz UV por 15 min.
2. Substitua a solução HBSS da suspensão de neutrófilos no passo 2.5 por um meio RPMI 1640 suplementado com plasma autólogo a 10%. À placa de 24 poços (passo 5.1), adicionar 350 μL desta suspensão celular, para uma concentração final de 2 x 10⁵ neutrófilos/poço.
3. Permitir que as células adiram ao fundo dos poços incubando por 20 min a 37 °C com 5% de CO₂.
4. Adicione os estímulos para induzir a formação de NET em 50 μL: estímulos microbianos-gram-positivos bactéria S. aureus (ATCC 25923), bactéria gram-negativa P. aeruginosa (ATCC 10145) no MOI 100 e pseudo-hifas de C. albicans (ATCC 10231) no MOI:1; estímulos bioquímicos-PMA (200 nM) e HOCl (4,5 mM), e controle com estímulo ausente (50 μL de HBSS).
5. Obter um volume final de 400 μL por poço. Misturar num agitador de placas a 140 rpm durante 30 s e incubar durante 4 h a 37 °C e 5% de CO₂.

6. Visualização de TNEs por microscopia de fluorescência

1. DNA e imunocoloração LL37
   1. Após a indução NET, remova os sobrenadantes dos poços pipetando cuidadosamente e fixe as células com 300 μL de paraformaldeído a 4% por 30 min.
   2. Lave as células com 200 μL de 1x PBS sem centrifugação e adicione 200 μL de tampão de bloqueio (10% de plasma descomplementado em 1x PBS) por 30 min.
   3. Para a coloração LL-37, permeabilizar as células com 200 μL de Triton X-100 a 0,2% em PBS 1x por 10 min para permitir que o anticorpo entre nas células. Lave 2x cuidadosamente com 1x PBS para remover o excesso de detergente.
   4. Monte as tampas em lâminas de vidro (quatro folhas de cobertura em cada lâmina). O DNA cora as células com 2 μL de DAPI (ver Tabela de Materiais), sela as folhas de cobertura e armazena a -20 °C até sua análise por microscopia de fluorescência confocal.
2. Aquisição e análise de imagens fluorescentes
   1. Pegue imagens NET para quantificar seus componentes e use os filtros correspondentes no microscópio de fluorescência confocal (consulte Tabela de materiais) para adquirir as imagens com o software do computador.
      NOTA: Considere que o DNA é corado com DAPI (cor azul), mostrando excitação a 360 nm e emissão a 460 nm. Os microrganismos são corados com CFSE (cor verde), que tem uma excitação de 492 nm e uma emissão de 521 nm. O peptídeo LL37 é marcado com anticorpo anti-LL37 Alexa Fluor 594 (cor vermelha), que tem uma excitação de 594 nm e uma emissão de 614 nm.
   2. Calibre o microscópio. Coloque o slide e o foco usando contraste de interferência diferencial (DIC) com a luz normal acesa. Escolha Live para projetar a imagem no monitor.
   3. Desligue a luz e selecione o canal correspondente do fluorocromo. Por exemplo, selecione filtro 365 nm/azul para DAPI, 43 HE DsRed para Alexa 594 ou GFP 38 HE para CFSE.
   4. Ajuste as configurações com o anticorpo de controle de isotipo para LL37 e células não coradas para DAPI e CFSE. Defina as mesmas configurações de tempo de exposição, tensão, contraste e lente para capturar todas as imagens sob as mesmas condições.
      NOTA: Neste estudo, o tempo de exposição, a tensão e o contraste foram fixados em 1,0 ms, 4,0 V e 0,0, respectivamente, com objetivo de 40x. Esses valores podem ser ajustados para facilitar a melhor captura de imagem para as amostras.
   5. Selecione Ajustar para capturar a imagem. Salve cinco imagens (quatro extremos e o centro) por poço, e da colocalização (fusão) de DNA/LL37/CFSE.
   6. Defina as três classes de pixels como plano de fundo com as imagens independentes de cada cor e analise o valor do Sinal Cinza Médio por área com o software Image J.

7. Quantificação da atividade enzimática

1. Em uma placa de 96 poços, adicionar 90 μL de suspensão celular em HBSS contendo 1 x 10 5 neutrófilos para indução NET e incubar por 20 min a 37 °C e⁵ % de CO₂.
2. Imediatamente adicionar 10 μL dos estímulos correspondentes (concentração como na etapa 5.4) e incubar por 4 h a 37 °C com 5% de CO₂.
3. Descarte os sobrenadantes e lave as células com 100 μL de HBSS. Tratar com 1 U/mL de DNase por 10 min a 37 °C para favorecer a liberação de estruturas DNA-proteína e centrifugar a 1.800 x g por 10 min.
4. Recuperar os sobrenadantes e avaliar a atividade enzimática no sobrenadante utilizando reações colorimétricas conforme descrito anteriormente por White et ^al.17.
5. Determinar a atividade enzimática máxima de NE, CG e MPO em neutrófilos sob as mesmas condições experimentais sem adicionar nenhum estímulo para indução NET. Em seguida, congelar a amostra celular a -70 °C e descongelar a 37 °C em banho-maria, gerando um choque de temperatura para favorecer a liberação de proteínas intracelulares por lise celular. Centrifugar a 1.800 x g por 10 min e recuperar os sobrenadantes.
6. Adicionar 50 μL do sobrenadante a cada poço em placas de 96 poços e, em seguida, adicionar 50 μL de cada substrato, conforme indicado na etapa 7.7.
7. Adicionar 0,5 M de N-metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitro anilina como substrato para NE, e 1 mM de N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide para CG. Incubar durante 3 h à temperatura ambiente. No caso da OSM, adicionar 1,6 mM de 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
8. Após incubação, adicionar 50 μL da solução de parada (0,5 M H₂SO₄) para MPO e medir a absorbância a 405 nm para NE e CG e 450 nm para MPO, usando um espectrofotômetro.
9. Comparar os valores obtidos com as curvas de calibração correspondentes e mostrar os resultados de cada condição em relação à atividade enzimática máxima (100%).

8. Análise estatística

1. Analise os dados de medição em triplicado para cada experimento independente (n = 10) e realize uma ANOVA para análise estatística, comparando grupos com um nível de confiança de 95%.

Figura 1: Purificação de PMN e protocolo de indução NET. (A) O plasma foi retirado do sangue periférico para obtenção da embalagem de eritrócitos e leucócitos e diluído 1:1 (v/v) com 1x DPBS. Em seguida, 4 mL da diluição foram adicionados ao longo da parede ao tubo de gradiente de dupla densidade, e centrifugados a 320 x g por 20 min a 4 °C, obtendo-se a separação das diferentes camadas celulares e recuperando-se a correspondente ao PMN. (B) As células purificadas foram contadas e sua morfologia foi analisada pela coloração de Wright. A viabilidade foi determinada pela exclusão do azul de tripano e coloração da DAAA 7 por citometria de fluxo. Uma vez verificada a pureza e a viabilidade ideais dos neutrófilos, a formação de NET foi induzida pela adição de micróbios (S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans) ou produtos químicos (PMA, HOCl) em placas de 24 poços para análise por microscopia de fluorescência com DAPI-DNA, anti-LL37 Alexa Fluor 594 e coloração de microrganismos-CFSE. Para quantificação enzimática, os TNEs foram induzidos em placas de 96 poços por 3 h e tratados com DNase, seguidos da adição de substratos para cada enzima: NE, GC e MPO; as alterações de cor foram quantificadas por espectrofotometria. DPBS = solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco; PBMC = Células mononucleares do sangue periférico; PMN = neutrófilos polimorfonucleares; NE = Elastase de neutrófilos; GC = Catepsina G; MPO = Mieloperoxidase; PMA = Acetato de miristato de Phorbol; HOCl = Ácido hipocloroso. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Pureza e viabilidade dos neutrófilos
As fases celulares dinâmicas são visualizadas no tubo a partir da purificação do gradiente de dupla densidade. Dentro dessas camadas, a camada correspondente aos granulócitos está acima da camada de densidade de 1,079 g/mL, distinta das fases de mononucleócitos do sangue periférico (PBMCs) e eritrócitos (Figura 1A). A morfologia das células purificadas foi verificada com a coloração de Wright por meio da observação de c?...

Discussão

Uma população altamente pura de neutrófilos viáveis deve ser obtida para induzir a liberação de TNEs, uma vez que essas células têm uma vida útil ex vivo limitada de 8 h em média, um período dentro do qual todos os experimentos devem ser realizados. Para tanto, a metodologia ideal é o gradiente de dupla densidade para otimizar o tempo de purificação, isolando células não ativadas mais responsivas à estimulação exógena, em contraste com o gradiente Ficoll-Histopaque ou as técnicas de sediment...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 Well plate for cell culture	Corning	3526
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	51-668981E
96 Well plate for cell culture	Costar	3596	Flat bottom
Agitator	CRM Globe	CRM-OS1
Antibody LL37	Santa Cruz Biotechnology	sc-166770
Blood collection tubes	BD VACUTAINER	368171	K2 EDTA 7.2 mg
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Sigma-Aldrich	21878
Centrifuge	Hettich	1406-01
Coverslip	Madesa	M03-CUB-22X22	22 mm x 22 mm
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS)	Caisson	1201022
Falcon tubes 50 mL	CORNING	430829
Flow Cytometry Tubes	Miltenyi Biotec		5 mL - Without caps
FlowJo Software	BD Biosciences		Analyze flow cytometry data
Fluorescence microscope	DM 2000	LEICA
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Incubator	NUAIRE	UN-4750
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec		Flow cytometer
Microplate reader photometer	Clarkson Laboratory - CL
Microtubes 1.5 mL	Zhejiang Runlab Tech	35200N	wire snap
Minitab Software	Minitab		Statistical analysis
Needles	BD VACUTAINER	301746	Diameter 1.34 mm
Optical microscope	VELAB	VE-B50
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Solution for density gradient
Phosphate Buffered Saline (10x)	Caisson	PBL07-500ML
Pyrex culture tubes	CORNING	CLS982025	N°9820
RPMI 1640 1x	Corning	10-104-CV	contains Glutagro
Slides	Madesa	PDI257550	22 mm x 75 mm
Trypan Blue solution 0.4%	SIGMA	T8154-100ML