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Os enteróides estão emergindo como um novo modelo para o estudo da fisiologia e fisiopatologia tecidual, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa. Aqui, descrevemos um sistema de cultura 2D derivado de enteróides de células primárias bovinas que permite o co-cultivo com tipos de células teciduais relevantes. Este modelo oferece uma vantagem translacional para a modelagem de pesquisa gastrointestinal.
Sistemas de cultura de células organoides podem recapitular a complexidade observada nos tecidos, tornando-os úteis no estudo das interações patógeno-hospedeiro, avaliação da eficácia e toxicidade de fármacos e bioengenharia tecidual. No entanto, a aplicação desses modelos pelas razões descritas pode ser limitada devido à natureza tridimensional (3D) desses modelos. Por exemplo, o uso de sistemas de cultura enteróide 3D para estudar doenças digestivas é um desafio devido à inacessibilidade do lúmen intestinal e suas substâncias secretadas. De fato, a estimulação de organoides 3D com patógenos requer microinjeção luminal, ruptura mecânica da estrutura 3D ou geração de enteroides apical-out. Além disso, esses organoides não podem ser co-cultivados com células imunes e estromais, limitando a análise mecanicista aprofundada da dinâmica fisiopatológica. Para contornar isso, otimizamos um sistema de cultura de monocamada derivada de enteróides bovinos bidimensionais (2D), permitindo o co-cultivo com outros tipos celulares relevantes. Criptas ileais isoladas de bovinos adultos saudáveis foram cultivadas para gerar organoides 3D que foram criopreservados para uso futuro. Uma monocamada 2D foi criada usando enteróides 3D revividos que foram passados e interrompidos para produzir células únicas, que foram semeadas em inserções de cultura de células transwell revestidas com extrato de membrana basal, expondo assim sua superfície apical. A polaridade da monocamada intestinal, a diferenciação celular e a função de barreira foram caracterizadas por microscopia de imunofluorescência e mensuração da resistência elétrica transepitelial. A estimulação da superfície apical da monocamada revelou a funcionalidade esperada da monocamada, demonstrada pela secreção de citocinas dos compartimentos apical e basal. O modelo de monocamada 2D derivado de enteróides descrito é uma grande promessa na investigação de interações patógeno-hospedeiro e fisiologia intestinal, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa.
Modelos animais em pesquisa desempenham um papel crucial em melhorar nossa compreensão da fisiopatologia da doença e da dinâmica da resposta imune do hospedeiro durante a infecção e apoiar o desenvolvimento de novas estratégias preventivas e terapêuticas 1,2,3,4. Esses modelos apoiam a descoberta e o avanço da pesquisa em animais e são fundamentais para o progresso da pesquisa em saúde humana. Durante décadas, modelos de roedores têm sustentado avanços nos mecanismos imunológicos e na pesquisa biológica fundamental para doenças humanas 3,5,6,7. Enquanto os modelos de roedores são críticos na triagem e na pesquisa de desenvolvimento inicial, os modelos animais de grande porte oferecem uma comparação mais relevante na pesquisa de doenças humanas tanto em estudos de descoberta precoce quanto em estudos de desenvolvimento posteriores, incluindo testes de eficácia terapêutica e segurança 1,3,4,5. A pecuária oferece vantagens claras em relação aos modelos de roedores para uma tradução mais eficiente para aplicações humanas em algumas doenças, incluindo criptosporidiose, salmonelose, tuberculose, vírus sincicial respiratório e brucelose 1,7,8. De fato, essas e outras doenças se desenvolvem espontaneamente em bovinos, que compartilham várias patogêneses e processos imunológicos análogos à humana, e como uma população extrovertida, os bovinos mimetizam a heterogeneidade genética e ambiental que influencia as respostas imunes humanas 5,8,9,10 . Os benefícios dos modelos bovinos para a pesquisa de doenças infecciosas podem ser maximizados empregando-se primeiro um sofisticado sistema de cultura e, em seguida, implementando estudos in vivo em etapas. O uso inicial de um sistema de cultura derivado de bovinos altamente complexo pode reduzir consideravelmente o número de estudos com animais vivos, ao mesmo tempo em que melhora as chances de sucesso da pesquisa translacional e aplicada. Modelos de cultura devem recapitular os processos patológicos em nível de órgão para uma validade preditiva ótima, retendo o microambiente do tecido nativo espacial e funcionalmente.
A resposta imune mucosa é um sistema multifacetado composto por uma barreira altamente eficiente formada por enterócitos gastrintestinais e diversas populações de células imunes localizadas abaixo da superfíciemucosa11. Esse sistema altamente complexo é crítico durante a infecção para manter a homeostase gastrointestinal e iniciar defesas imunológicas contra patógenos entéricos11. A comunicação entre enterócitos e células imunes inatas subjacentes inicia o desenvolvimento de respostas imunes protetoras contra microrganismos patogênicos. Assim, sistemas de cultura que são comparativos em seu nível de complexidade são necessários para uma investigação ótima das interações patógenos entérico-hospedeiro e são altamente eficazes na compreensão da fisiologia entérica e na descoberta e desenvolvimento de fármacos12,13. Os organoides são um sistema de cultura robusto que se assemelha à arquitetura e função do tecido de origem14,15. A multicelularidade desses modelos permite investigar o papel de diversas populações celulares e as interações celulares envolvidas na saúde e doença entérica12,14. No entanto, modelos organoides derivados de humanos em pesquisa são atualmente limitados pela dificuldade de se obter uma quantidade suficiente e qualidade consistente de células epiteliais intestinais humanas e limitada viabilidade celular em cultura. Linhagens celulares imortalizadas podem ser usadas para obter altos rendimentos de culturas homólogas nesses modelos de forma consistente; no entanto, as células transformadas carecem inerentemente da diversidade e complexidade funcional das células epiteliais não transformadas16,17. As vantagens do uso de culturas derivadas de tecido bovino como modelo para investigação de doenças e fisiologia gastrintestinal incluem a facilidade com que amostras de tecido podem ser consistentemente obtidas de doadores saudáveis, melhor viabilidade celular e maior diversidade celular alcançável apenas com tecidos não imortalizados. A transcriptômica tecidual comparativa e a caracterização de organoides intestinais revelam semelhanças em genes ortólogos conservados e potenciais celulares entre humanos e bovinos18. Portanto, um sistema de cultura derivado de organoides bovinos pode ser vantajoso na investigação de doenças intestinais humanas, com achados facilmente traduzíveis para a medicina humana.
O protocolo aqui descrito detalha uma plataforma eficaz para avaliar as respostas do hospedeiro a patógenos ou compostos entéricos e a fisiologia intestinal usando um sistema de cultura de células primárias 2D derivado de enteróides bovinos. Ao contrário dos organoides 3D, os sistemas de cultura 2D gerados em inserções transwell permitem uma cultura dupla de células intestinais com células imunes ou estromais, permitindo o estudo da dinâmica em nível de tecido. Com aplicações em pesquisa biomédica, desenvolvimento farmacêutico e testes de eficácia, esse modelo fisiologicamente relevante pode beneficiar a saúde e o avanço tanto do gado quanto das pessoas.
Todos os protocolos foram realizados de acordo com as diretrizes e normas institucionais e nacionais de bem-estar animal.
1. Preparação dos reagentes
OBS: Os estoques e as concentrações finais dos reagentes utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1.
2. Isolamento das criptas intestinais de todo o tecido (Figura 1)
NOTA: Enteróides do intestino delgado bovino foram gerados a partir de tecido ileal obtido de novilhos adultos saudáveis da raça Holandesa (>2 anos de idade) de uma planta de processamento de carne bovina local. Um doador foi utilizado para esta série de experimentos.
3. Geração e passagem ex vivo de enteróides ileais bovinos (Figura 2)
NOTA: As criptas dos tubos cônicos com as criptas intestinais mais puras e intactas serão usadas para ensaios a jusante. Para todas as etapas que envolvem criptas e enteróides, as pontas de pipeta, raspadores de células e tubos devem ser pré-revestidos com o tampão de revestimento, e bolhas devem ser evitadas para evitar a perda de criptas. Salvo indicação em contrário, uma ponta de pipeta de 1000 μL deve ser usada para evitar a quebra de fragmentos de cripta.
4. Geração e avaliação de monocamadas 2D a partir de enteróides 3D
NOTA: Como acima, para todas as etapas que envolvem criptas e enteróides, as pontas de pipeta, raspadores de células e tubos devem ser pré-revestidos com o Buffer de Revestimento, e bolhas devem ser evitadas para evitar a perda de criptas.
O primeiro passo na geração das monocamadas derivadas de enteróides 2D é preparar o corte do tecido intestinal colhido (Figura 1A) para a dissociação tecidual. Isso é feito removendo-se a gordura aderida e o mesentério do tecido (Figura 1B), seguido do corte longitudinal do tecido para expor a superfície do lúmen para que a camada de muco do intestino possa ser removida por raspagem suave usando uma lâmina de vidro. O corte intestinal colhido é então cortado em cortes de tecido progressivamente menores (Figura 1C) para aumentar a facilidade de dissociação. As criptas são então dissociadas do tecido submucoso subjacente usando uma série de lavagens consistindo de tampões quelantes (Figura 1D,E) e PBS. As criptas intestinais isoladas (Figura 1F) são então incluídas em cúpulas matriciais da membrana basal (Figura 2A) e cultivadas por vários dias para gerar enteróides 3D. A partir de uma seção de 10 polegadas do íleo bovino, aproximadamente 900.000 criptas podem ser isoladas e usadas para a formação de enteróides. Após apenas algumas horas em cultura, as criptas plaqueadas começam a se alongar e evoluir para enterosferas (Figura 2B). Após 2 dias, observa-se lúmen bem definido (Figura 2C), com brotamento de estruturas notadas já no 4º dia de cultura (Figura 2D). No 7º dia, enteroides maduros já se desenvolveram (Figura 2E). A coloração por imunofluorescência do enteróide 3D de 7 dias de idade demonstra a presença de diferentes linhagens celulares. A microscopia confocal dos enteróides demonstra a localização da coloração nuclear DAPI, da proteína E-caderina na junção aderente, da coloração Cromogranina-A (Chr-A) mostrando a presença de células enteroendócrinas, da lisozima (LYZ) demonstrando as células de Paneth, e da citoqueratina-18 (CK-18) representando as células dos enterócitos na Figura 3. Após 7-10 dias em cultura, os enteroides devem ser passados para permitir maior expansão e evitar a superlotação. O tempo ideal para a passagem de enteróides foi determinado como sendo de 7-10 dias após o isolamento inicial da cripta primária e, em última análise, depende da saúde e da taxa de crescimento dos enteroides em cultura. A densidade de semeadura ideal para atingir a morfologia e viabilidade enteróide desejadas, como ilustrado na Figura 2E, é de 400 criptas por cúpula. Os enteróides podem ser facilmente criopreservados, e os fragmentos enteroides descongelados se recuperam totalmente para uso experimental após duas passagens pós-descongelamento. Notavelmente, pelo menos duas passagens da cultura primária da cripta são recomendadas antes da criopreservação.
Para produzir uma monocamada derivada de enteróides 2D, os enteróides 3D são colhidos e, ao longo de uma série de etapas, são triturados mecanicamente na presença de uma solução de dissociação (Figura 4A) em células únicas. Essas células individuais podem então ser semeadas em uma inserção de transwell que foi pré-revestida com uma solução de meio de cultura de matriz de membrana basal. Em média, quatro transwells podem ser semeados a partir de quatro cúpulas enteróides 3D. O número de enteróides 3D processados é, portanto, dependente do número de transwells necessários para o experimento. Planear células isoladas a uma densidade de semeadura de 1 x 105 e inicialmente cultivá-las na presença de 20% de SFB (Figura 4B-D) pode gerar uma monocamada confluente em menos de 1 semana. A confluência progressiva da monocamada 2D em cultura pode ser monitorada ao longo do tempo por meio de microscopia de luz (Figura 4E,F). Medidas da resistência elétrica transepitelial (TEER) podem confirmar a confluência e caracterizar a integridade da barreira epitelial ao longo do tempo e em resposta à estimulação experimental (Figura 5A). Em média, após sete dias em cultura, uma monocamada aproximadamente 100% confluente terá um valor TEER correspondente de ~1500 Ω·cm2. Uma avaliação longitudinal dos valores de TEER da monocamada enteróide 2D demonstra um aumento constante nos valores de TEER ao longo de sete dias, atingindo um valor médio máximo de 1546 Ω·cm2 antes de declinar com o menor valor de 11,5 Ω·cm2 obtido no dia doze (Figura 5B). A marcação imunofluorescente de monocamadas diferenciadas indica que folhas epiteliais intestinais íntegras, organizadas e polarizadas são formadas usando este protocolo (Figura 6). A microscopia confocal da monocamada corada 2D demonstra a localização da coloração nuclear DAPI, E-caderina e F-actina (Figura 6A-D). A microscopia de fluorescência da monocamada 2D mostra características de células epiteliais intestinais diferenciadas com coloração de cromogranina-A (Chr-A) mostrando a presença de células enteroendócrinas, lisozima (LYZ) demonstrando células de Paneth, e citoqueratina-18 (CK-18) indicando linhagens de células de enterócitos (Figura 6E-L). A modelagem Z-stack mostra a polarização esperada da cultura da monocamada 2D com deposição característica de F-actina que é encontrada nas microvilosidades que recobrem o aspecto apical dos enterócitos diferenciados e E-caderina, uma proteína localizada nas junções aderentes interespaçadas entre as células epiteliais (Figura 6M).
A funcionalidade da monocamada pode ser avaliada por estimulação apical com vários componentes, incluindo ligantes ou patógenos do receptor Toll-like (TLR), seguida da quantificação de citocinas de sobrenadantes de culturas celulares colhidas dos compartimentos apical e basal. De fato, quando o aspecto apical da monocamada é estimulado por 24 h com o agonista Pam3csk4 do TLR 1/2 no 4º dia de cultura, observa-se aumento da produção de citocinas em ambos os compartimentos em relação às monocamadas não tratadas (Figura 7A,B).
Figura 1: Isolamento de criptas intestinais bovinas de bovinos adultos saudáveis. Imagens ilustrando o processamento tecidual de (A) íleo bovino adulto inteiro, (B) íleo desengordurado, (C) íleo seccionado em pedaços de 2,5 polegadas (6,3 cm) em PBS sobre gelo, (D) cortes de tecido ileal em tampão de dissociação #1 a 4 °C e (E) em tampão de dissociação 2 em banho de água agitada a 37 °C e (F) fragmentos isolados de cripta ileal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Desenvolvimento enteróide ileal 3D primário bovino em matriz de membrana basal. Imagens representativas de (A) cúpulas enteróides 3D criadas em placa de cultura de tecidos de 6 poços e desenvolvimento enteróide (B-E) 3D dos dias 0, 2, 4 e 7 em cultura. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Enteróides intestinais tridimensionais mostram coloração de linhagem celular epitelial. Imagens representativas de enteróides 3D após 7 dias em cultura demonstram a presença de corante nuclear, F-actina, citoqueratina-18 (CK-18), Cromogranina-A (Chr-A), Acaderina (E-cad), lisozima (Lyz) e sobreposição de imagens (Merge). Barra de escala 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Estabelecimento da monocamada 2D derivada de enteróides ileais. Imagens representativas de (A) fragmentos enteróides 3D em solução de dissociação em preparação para semeadura de monocamada, células únicas plaqueadas em uma inserção de transpoço a uma densidade de semeadura de 1 x 105 imageadas no dia 0 usando (B) luz, (C) contraste de fase e (D) microscopia de campo brilhante, e desenvolvimento de monocamada em insertos de transwell imageados no quinto dia usando (E) contraste de fase e (F) microscopia de campo claro. Aumento de 40x e barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Medidas da resistência elétrica transepitelial (TEER) da monocamada 2D derivada do enteróide em insertos transwell. (A) Diagrama esquemático de como as medidas TEER da monocamada de células epiteliais intestinais (IEC) 2D são obtidas usando os eletrodos de pauzinho STX2 de um voltohmímetro, (B) Monitoramento longitudinal de medidas TEER de monocamada 2D durante 12 dias em cultura celular. Cada ponto de dados representa um valor TEER médio e um erro padrão da média (EPM) obtidos a partir de duas réplicas técnicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Monocamadas diferenciadas derivadas de enteróides 2D em inserções transwell desenvolvem-se em lâminas epiteliais intestinais polarizadas. (A-M) Imagens representativas de imunofluorescência de uma monocamada 2D derivada de enteróides na inserção transwell após 5 dias em cultura mostrando o núcleo (A) (azul), (B) E-caderina (vermelho), (C) F-actina (verde) e (D) sobreposição das 3 imagens (fusão), (E,I) coloração nuclear, (F) cromogranina-A, (J) citoqueratina-18, (G,K) lisozima e (H,L) fusão de imagens. (M) Modelagem Z-stack mostrando a distribuição das mesmas proteínas marcadores de células epiteliais da folha 2D da monocamada. As imagens foram obtidas a partir de 2 réplicas biológicas. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: As monocamadas primárias 2D derivadas de enteróides bovinos em insertos transwell são funcionalmente ativas. Secreção de citocinas sobrenadantes em cultura de células apicais e basais de (A) IL-1α e (B) IL-8 por monocamadas 2D em inserções transwell após 5 dias em cultura que não foram tratadas ou estimuladas com Pam3csk4 por 24 h. Os dados são representativos dos níveis médios de citocinas e MEV de monocamadas derivadas de estoques congelados de criptas de um animal e três experimentos independentes. As citocinas foram quantificadas utilizando-se o ensaio multiplex baseado em esferas (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante e analisadas em uma unidade de multiplexação compacta (Tabela de Materiais) e software de ajuste de curva de imunoensaio (Tabela de Materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quadro 1: Existências e concentrações finais dos reagentes. Clique aqui para baixar a tabela.
O protocolo aqui apresentado descreve um modelo fisiologicamente relevante para a investigação da fisiologia intestinal e distúrbios entéricos. Vários grupos de pesquisa têm descrito a geração de culturas enteróides bovinas, incluindo monocamadas 2D 16,19,20,21,22,23,24. Embora a geração de monocamadas não seja tecnicamente desafiadora, etapas de vários minutos são críticas para desenvolver culturas bem-sucedidas de forma consistente. Como tal, a reprodutibilidade de monocamadas 2D usando os métodos brevemente descritos na literatura publicada pode ser um desafio para um pesquisador iniciante na área de organoides empreender. O protocolo aqui descrito é adaptado desses protocolos e daqueles publicados em outras espécies, fornecendo um guia passo-a-passo para a geração de monocamadas em insertos de transpoços que é altamente reprodutível.
O protocolo aqui descrito pode ser facilmente modificado para se adequar aos objetivos específicos do planejamento experimental ou à disponibilidade de reagentes. De fato, seguindo esse protocolo, culturas bem-sucedidas podem ser obtidas pela semeadura de monocamadas em uma densidade celular mais baixa (por exemplo, 2,5 x 104) ou na ausência de SFB, como descrito em outras publicações24. No entanto, a alteração desses parâmetros pode exigir um aumento da cultura para estabelecer uma monocamada confluente. Como tal, se outros fatores integrantes do desenho do estudo, incluindo o co-cultivo com células imunes, ditarem um curso de tempo específico para o experimento, a densidade de semeadura pode ser alterada conforme necessário. Enquanto outras formulações de membrana basal podem ser substituídas pela usada neste protocolo para gerar enteróides 3D e monocamadas 2D, estas exigirão alguma otimização para determinar a relação membrana basal-mídia ideal.
A aplicação de insertos transwell na metodologia descrita tem muitos benefícios sobre o crescimento de monocamadas em plasticware convencional e culturas enteróides 3D. Comparado às placas de cultura de tecidos padrão, o uso de transwells para culturas de monocamadas promove diferenciação e organização celular de forma a manter semelhança com criptas intestinais 14,25. A barreira epitelial intestinal é vital para prevenir a translocação de toxinas e microrganismos para o corpo, ao mesmo tempo em que facilita a absorção de nutrientes. Como tal, é fundamental entender como a integridade da barreira do intestino funciona de forma saudável e é alterada durante distúrbios intestinais ou em resposta a compostos. Diferentemente das culturas enteroides 3D, a avaliação objetiva da integridade da barreira intestinal é possível ao combinar monocamadas em transwells e medir o TEER, como demonstrado aqui14,25. A geração de monocamadas 2D em transwells também permite o cultivo duplo com tipos celulares pertinentes, como células imunes ou estromais. Isso permite caracterizar o crosstalk criticamente importante entre células intestinais e células do microambiente tecidual, o que não pode ser alcançado com culturas 3D. A exposição da superfície apical da monocamada não só permite a exposição experimental a patógenos e compostos e a coleta de produtos luminais, mas também proporciona estudos sobre outros aspectos da fisiologia intestinal e da doença, incluindo a investigação da microbiota intestinal e da fisiologia molecular da absorção ou transporte13. O controle independente sobre as superfícies intestinais apicais e basais é uma vantagem distinta em relação aos modelos enteroides 3D.
Através de vários experimentos experimentais, identificamos as principais etapas que contribuíram para o sucesso do protocolo. Enquanto amostras de tecido intestinal inteiro podem ser refrigeradas durante a noite e processadas no dia seguinte, as etapas de dissociação e isolamento do fragmento de cripta devem ser realizadas prontamente para evitar a desintegração das frações de criptas isoladas. Depois de concluir as lavagens PBS, centrifugar as criptas na mídia de lavagem pode ajudar a evitar a quebra da cripta, conforme detalhado na etapa 2.3.10. Ao passar os enteróides ou colhê-los para a formação de monocamadas, é essencial separar os enteróides das cúpulas BME. O meio de lavagem deve ser gelado para ajudar na dissolução da EMB. Em contraste, usar TrypLE pré-aquecido e filtrar a suspensão celular duas vezes pode ajudar a formar as células únicas necessárias para a geração de monocamadas. Finalmente, manobrar manualmente a placa na forma do número 8 pode ajudar a dispersar uniformemente as células individuais sobre a inserção do transwell.
Uma limitação importante deste protocolo é que as monocamadas 2D foram produzidas a partir de estoques enteróides gerados a partir de um novilho holandês maduro (>2 anos de idade). A maturação do trato gastrointestinal em bezerros pode necessitar de pequenas modificações no protocolo descrito para obter resultados ótimos. Diferenças raça-específicas na fisiologia intestinal de raças bovinas têm sido descritas na literatura26. Embora não se saiba se essas diferenças poderiam afetar a geração de enteroides e subsequentes monocamadas, suspeitamos que quaisquer diferenças resultariam em apenas pequenas mudanças em nosso protocolo. Além disso, o modelo de cultura 2D tem algumas desvantagens inerentes. Comparadas aos modelos enteróides 3D, as culturas 2D podem carecer de alguns aspectos da arquitetura do tecido intestinal e da diversidade celular e criar restrições e desafios associados à propagação da cultura 2D13. Ainda assim, estudos demonstram que algumas monocamadas podem emular a organização esperada de criptas27, e algumas dessas limitações podem até ser superadas com o estabelecimento de culturas 2D com uma interface ar-líquido. No entanto, as limitações desse modelo devem ser plenamente consideradas para determinar se sua aplicação é adequada para a questão experimental que está sendo feita.
Este protocolo descreve um sistema de cultivo otimizado que modela o trato gastrointestinal bovino usando enteróides derivados do íleo bovino para formar monocamadas em insertos transwell. Com uma ampla gama de aplicações, desde a pesquisa de doenças infecciosas até a descoberta de medicamentos e medicina regenerativa, esse sistema de cultura de alto rendimento pode levar ao desenvolvimento sem precedentes de estratégias preventivas e terapêuticas que podem ser mutuamente benéficas para a saúde animal e humana.
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Agradecemos o uso do Cellular and Molecular Core Facility da Midwestern University.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 mL pipette tip | MidSci | PR-200RK-S | |
1 µm PET 24-well cell culture inserts | Corning | 353104 | |
1000 mL pipette tip | MidSci | PR-1250RK-S | |
22 G needle | Becton, Dickinson and Company | 305156 | |
24-well culture vessel | Corning | 353504 | |
40 μm cell strainer | Corning | 431750 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher scientific | 14-955-240 | |
5-mL pipet tip | Fisher scientific | 30075307 | |
5 mL syringe | Becton, Dickinson and Company | 309647 | |
5 mL tube | Eppendorf | 30119401 | |
Anti-Cytokeratin -18 (C-04) | Abcam | AB668-1001 | |
B-27 supplement without vitamin A | Gibco | 12-587-010 | |
Belysa software | Luminex | 40-122 | Immunoassay curve fitting software |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher bioreagents | BP9704-100 | |
Caspofungin acetate | Selleckchem | S3073 | |
Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
Chromogranin-A (E-5) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271738 | |
Coverslips | Fisher scientific | 12-540-C | |
Cryovials | Neptune scientific | 3471.X | |
Cultrex Ultimatrix RGF BME | R&D Systems | BME001-05 | |
DAPI | MilliporeSigma | D9542-5MG | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-588 | |
Dithiothreitol (DTT) solution | Thermo Scientific | FERR0861 | |
DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES) | Cytiva | SH30271.01 | |
E-cadherin | Cell Signaling Technology | #3195 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | BP2482500 | |
FBS | Corning | MT35070CV | |
Gentamicin | Gibco | 15710064 | |
Glass microscope slide | Fisher scientific | 12-550-07 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
Hemacytometer | Bio-Rad | 1450015 | |
IntestiCult organoid Differentiation medium (Human) | StemCell Technologies | 100-0214 | |
IntestiCult organoid growth medium (Human) | StemCell Technologies | 0-6010 | |
Keyence BZ-X700 | Keyence | BZ-X700 | |
LY2157299 (Galunisertib) | Selleckchem | S2230 | |
MAGPIX system | Luminex | Magpix system | Compact multiplexing unit |
Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel | MilliporeSigma | BCYT1-33K | Bead-based multiplex assay |
Mr. Frosty container | Nalgene | 5100-0001 | |
Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution | ATCC | 30-2103 | |
NutriFreeze D10 Cryopreservation Media | Biological Industries | 05-713-1B | |
Orbital shaking platform | Thermo Fisher | 88880021 | |
Pam3Csk4 | invivogen | tlrl-pms | |
Parafilm sealing film | dot scientific inc. | #HS234526C | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Phalloidin-FITC | R&D Systems | 5782/12U | |
Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-20 | |
Prolong Glass Antifade | Invitrogen | P36982 | |
Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17) | Agilent technologies | A009902-2 | |
SB202190 (FHPI) | Selleckchem | S1077 | |
Shaking water bath | Thermo Fisher | MaxQ 7000 | |
Sodium Azide | VWR | BDH7465-2 | |
Streptomycin | Teknova | S6525 | |
Trypan Blue dye | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE express enzyme | Life technologies | 12604013 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | |
Voltohmmeter | MilliporeSigma | Millicell ERS-2 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
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ISSN 2689-3649
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