Co-cultura microfluídica de epitélio renal saudável e tumoral para modelar a progressão do câncer renal

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos que detalham instruções para a implementação de culturas de células 3D usando matrizes de colágeno e colágeno-agarose em um sistema microfisiológico. Esses protocolos suportam a co-cultura de esferoides de túbulo proximal renal e carcinoma de células renais, simulando condições in vivo e permitindo a investigação avançada das interações das células cancerígenas renais.

Resumo

Os sistemas microfisiológicos (MPS) têm possibilitado a introdução de elementos fisiológicos mais complexos e relevantes em modelos in vitro , recriando características morfológicas intrincadas em ambientes tridimensionais com interações dinâmicas ausentes nos modelos convencionais. Implementamos um modelo de co-cultura de carcinoma de células renais (CCR) para recriar a conversa cruzada entre tecido renal saudável e maligno.

Este modelo é baseado na plataforma de múltiplos órgãos referenciada e consiste na co-cultura de um túbulo proximal renal reconstruído com esferoides do CCR. Câmaras impressas em 3D projetadas sob medida foram usadas para cultivar células do túbulo proximal epitelial renal humano (RPTEC) e facilitar sua automontagem em um túbulo renal contido em uma matriz de colágeno tipo I. As células Caki-1 RCC foram incorporadas em uma matriz de colágeno em ágar, formando posteriormente esferoides cancerígenos. Tanto o colágeno quanto o ágar/gel de colágeno foram otimizados para manter sua integridade durante a perfusão cíclica e resistir ao estresse de cisalhamento durante um período mínimo de cultivo de 7 dias.

Os géis também permitem o fornecimento adequado de nutrientes e secreções celulares. Além disso, os géis de ágar/colágeno limitam a proliferação excessiva de células RCC, garantindo um tamanho esferóide relativamente homogêneo. Os circuitos microfluídicos do chip MPS compreendem duas câmaras de cultura independentes com o tamanho de um poço padrão de 96 microplacas. O túbulo renal e os géis do CCR preenchem câmaras separadas e compartilham o mesmo meio de cultura, que é recirculado aproximadamente duas vezes por minuto. Nessas condições, observamos regulação positiva da expressão e secreção do fator imune nos túbulos renais (interleucina-8 e fator de necrose tumoral-alfa). Os túbulos renais também mudam sua atividade metabólica para a glicólise sob a influência do CCR. Esta nova abordagem demonstra que um MPS baseado em co-cultura pode amplificar a complexidade do CCR in vitro e ser empregado para estudar o impacto do câncer em células não tumorais.

Introdução

Os avanços nos sistemas de cultura de células 3D revolucionaram a engenharia de tecidos e a medicina regenerativa, oferecendo modelos fisiologicamente mais relevantes em comparação com as culturas 2D tradicionais ^1,2. Neste estudo, utilizamos matrizes de gel de colágeno e colágeno-agarose, dada a sua capacidade de mimetizar o ambiente da matriz extracelular (MEC), promovendo comportamento e função celular mais precisos, ao mesmo tempo em que são compatíveis com as condições dinâmicas de cultura empregadas.

O colágeno, a proteína mais abundante na ME....

Protocolo

NOTA: Esses protocolos descrevem as etapas abrangentes para preparar géis de colágeno-agarose 3D, injetar células, perfundir as amostras e extraí-las para análise posterior. Ajuste os tempos e condições de incubação com base em requisitos experimentais específicos.

1. Preparação da matriz de gel de colágeno e agarose

1. Impressão 3D
   NOTA: Para criar a forma apropriada para a matriz de gel, desenvolvemos um design de câmara exclusivo que molda o gel em uma forma organoide fisiologicamente relevante (consulte o Arquivo Suplementar 1).
   1. Projete as câmaras ....

Resultados

O sistema HUMIMIC fornece um ambiente dinâmico que permite o fornecimento contínuo de nutrientes e oxigênio enquanto remove os resíduos metabólicos, mantendo assim a viabilidade e a função celular por longos períodos. Esses sistemas são particularmente benéficos para a criação de modelos complexos de órgãos em um chip que replicam o microambiente de tecidos específicos. Ele é projetado especificamente para aplicações de órgão em um chip e permite o controle preciso do.......

Discussão

O protocolo descrito neste estudo representa o desenvolvimento de um modelo complexo de câncer renal, alavancando a integração de dois tipos distintos de células - células epiteliais tubulares proximais renais (RPTEC / TERT1) e células de carcinoma de células renais (Caki-1) - dentro de matrizes específicas de colágeno e gel de colágeno-agarose em um sistema microfluídico. A preparação de géis de colágeno é fundamental para o sucesso deste modelo. A concentração precisa.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5-2.0 mL  tubes	Eppendorf	003012/10237-20205
24-well plates	Sarstedt	83.3922.500
3D printer	Prusa
Agarose	Carl Roth	3810.3
AutoDesk Tinker CAD software			computer-assisted design software
Caki-1 cells	ATCC	HTB-46
Caspase activity	Promega	G8090	Caspase 3/7 assay
Cell viability	Promega	G7570	Cell Titer Glo assay
Collagen Type I – rat tail, 3.0 mg/mL	Corning	354236
DMEM/12F Medium	PAN Biotech	PO4-41650
DPBS solution	PAN Biotech	P04-53500
Epidermal Growth Factor	Merck	E4127
Fetal Calf Serum	PAN Biotech	P30-3033
Genipin (30 mM)	Merck	G4796
HUMIMIC chips 2	TissUse		multi-organ chips
HUMIMIC control unit	TissUse		multi-organ chip control unit
Hydrocortisone	Merck	H6909
Incubator (37 °C, 5% CO2)	nd
Insulin,Sodium selenite,Transferrin (IST)	Merck	I1884
LDH release	Promega	J2380
Metal spatula	nd
NaOH (1 M)	Carl Roth	P031.2
Petri dishes	Sarstedt	82.1135.500
Polypropylene (PP) filament	Verbatin	55952
RNA-easy extraction kit	Qiagen	74104
RPTEC/TERT cells	ATCC	CRL - 4031
TNF-alfa ELISA	R&D Systems	DY210-05
Triiodothyronine (T3 )	Merck	709611
Trypsin-EDTA	PAN Biotech	P10-021100