Para começar, com um bisturi, faça uma incisão ao longo da linha média dorsal de um camundongo eutanasiado da região occipital até a região sacral. Usando um microscópio cirúrgico estereoscópico, dissecar cuidadosamente através de camadas até a coluna lombar. Identificar o último arco costal.
Identificar a última vértebra cervical e o sacro. Em seguida, faça um corte para separar a coluna. Com um par de pinças dissecantes, realizar uma laminectomia dorsal da vértebra para extrair a medula espinhal.
Remover os nervos que emergem através dos forames que constituem o sistema nervoso periférico. Agora, coloque a medula espinhal extraída em uma placa dissecante. Com uma tesoura de vannas, corte-a em pedaços de dois milímetros.
Em seguida, transfira as peças para um microtubo de fundo plano de dois mililitros. Adicione um mililitro de solução de trabalho HBSS-LD ao microtubo. Incubar a mistura a 37 graus Celsius durante 25 minutos.
Certifique-se de agitar vigorosamente a mistura a cada cinco minutos. Em seguida, passe o conteúdo de cada digestão através de um filtro de 40 mícrons. Em seguida, adicione sete mililitros de HBSS com 2% FBS para neutralizar a digestão e esmagar o tecido restante.
Transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros antes de centrifugar a 220 g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Agora use uma micropipeta de um mililitro para descartar o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet em dois mililitros de HBSS-FBS em um novo tubo cônico de 15 mililitros.
Adicione dois mililitros de meio de gradiente de densidade isotônico de 90% ao tubo e centrifugar a mistura a 160 g por 25 minutos a 18 graus Celsius. Finalmente, com uma pipeta de transferência, recupere a interfase e transfira-a para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave as células com 10 mililitros de PBS e, em seguida, centrifugue as células a 220 g por cinco minutos a cinco graus Celsius antes de novas experimentações.
A purificação das células microgliais extraídas produziu até 99% de rendimento celular, conforme confirmado pela coloração FACS. Células duplamente positivas com tamanho médio de 10 micrômetros compatíveis com micróglia não ativada foram observadas.
