Este trabalho foi apoiado pelo R24OD031956 de concessão OD do NIH. Agradecemos a Samantha Jalbert, Jill Ralston e Cora Anderson por sua assistência e apoio, bem como ao nosso editor e revisores anônimos por seus comentários úteis

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas e regulamentos do IACUC (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais) da Harvard Medical School (IS 00001365_3). Os resultados representativos são mostrados para um macho albino maduro perfundido e não perfundido Xenopus laevis.
1. Preparação experimental 
NOTA: Se o protocolo de perfusão8 estiver sendo seguido antes da amostragem, pule para a etapa 2.2.
<ol><li>Certifique-se de que a instituição de pesquisa aprovou a técnica de eutanásia descrita neste protocolo.</li>
	<li>Preparar uma solução de 5 g/L de MS-222 (metanossulfonato de tricaína) e 5 g/L de bicarbonato de sódio (ver Tabela de Materiais). O volume deve ser superior ao volume necessário para cobrir completamente os animais sujeitos à eutanásia. Verifique o pH para garantir que esteja ≥7.</li>
	<li>Realizar a eutanásia primária colocando o Xenopus na solução de eutanásia; O animal permanecerá submerso por um total de 1 h.</li>
	<li>Configure a estação de dissecação para que, imediatamente após a amostragem, todos os tecidos possam ser enxaguados em PBS resfriado ou PBS9 0,7x (dependendo das necessidades experimentais), verificados e aparados sob uma luz de ampliação de 5x (ou mais). Esta estação também deve permitir que o usuário substitua todas as pinças e tesouras ou limpe-as entre os usos.</li>
	<li>Uma vez que a rã esteja na solução por 1 h, a eutanásia primária foi concluída. Remova o sapo e verifique a perda de resposta à dor realizando uma pitada no pé.</li>
	<li>Registre os detalhes apropriados para o animal, como espécie, cepa, sexo, idade e estado de saúde, bem como se ele foi perfundido. Pese o Xenopus e faça medições adicionais, como o comprimento do focinho-respiradouro.</li>
	<li>Coloque o sapo de costas e prenda os membros proximais ao corpo (Figura 1).</li>
	<li>Usando uma tesoura de dissecção, corte a pele, suba pela linha média e depois lateralmente, fazendo dois retalhos.</li>
	<li>Consultando a Figura 2, identifique a linha alba e use uma pinça para agarrá-la e puxá-la para longe da cavidade celômica. Corte a musculatura cuidadosamente usando uma tesoura. Faça duas abas fora da parede da cavidade. Corte ou prenda todas as abas fora do caminho.</li>
	<li>Identifique o coração que ainda estará batendo. Use uma tesoura de dissecação para reduzir os ossos coracóides (Figura 2) para obter melhor acesso ao coração. NOTA: Se o coração parou de bater antes da amostragem, deve-se observar que o frescor da amostra foi comprometido.</li>
</ol>2. Amostragem
NOTA: Se o animal foi perfundido, pule para a etapa 2.2.
<ol><li>Identifique o pericárdio fino e puxe-o com uma pinça de tecido (Figura 3).</li>
	<li>Usando a ponta da tesoura de iridectomia, perfure suavemente o pericárdio, tomando cuidado para não cortar os tecidos subjacentes. Descasque o pericárdio para longe das 3 câmaras do coração.</li>
	<li>Use uma pinça para agarrar o ventrículo pelo ápice, identificar onde ele se liga às aurículas e ao tronco arterial (Figura 4) e cortá-lo abaixo dessas inserções (Figura 5). Se necessário, apare o ventrículo para que nenhum tecido das aurículas ou do tronco arterial fique visível, e o tecido da válvula de cor clara ainda seja visível dentro do ventrículo. NOTA: Em animais não perfundidos, a remoção do ventrículo pode ser qualificada como eutanásia secundária.</li>
	<li>Os 3 lobos do fígado serão visíveis (Figura 6 e Figura 7). Segure a borda do lobo esquerdo (à direita do espectador) e levante-a suavemente para que os ductos hepáticos e císticos fiquem visíveis (Figura 8). Faça uma amostra do 1/3 inferior do lóbulo abaixo desses acessórios (Figura 9).</li>
	<li>Para obter melhor acesso aos tecidos de uma rã, é útil remover o ovário. Identifique o ovário que está envolto em uma camada de peritônio visceral chamada epitélio germinativo. Desloque suavemente os lóbulos até que estejam em seus respectivos lados para tornar a área de fixação visível (Figura 10). Esses anexos são diretamente ventrais ao rim emparelhado.</li>
	<li>Usando uma tesoura, remova os ovários o mais próximo possível dos rins sem danificá-los (Figura 11).</li>
	<li>Inspecione o lobo medial (também chamado de lobo anterior) do fígado e observe como ele se conecta ao estômago e ao duodeno através do mesentério e do ducto hepatopancreático (também chamado de ducto colédoco comum) (Figura 6, Figura 7 e Figura 8).</li>
	<li>Corte o mesentério, o ligamento hepatoduodenal usando uma tesoura de iridectomia, bem como o ducto hepatopancreático onde ele encontra o duodeno. Corte a conexão do pâncreas e do ducto hepatopancreático ao lobo medial do fígado para que nenhum tecido hepático escuro fique preso (Figura 12).</li>
	<li>Segure o estômago com uma pinça dentada e a extremidade superior do pâncreas com uma pinça de tecido. Sob ampliação de 5x, retire suavemente o pâncreas do estômago (Figura 13). NOTA: Se não sair limpo, o tecido pancreático restante ficará visível e poderá ser retirado em fragmentos. Alternativamente, o pâncreas pode ser metodicamente descolamento usando tesouras de iridectomia e pinças de tecido.</li>
	<li>Consultando a Figura 14A, identifique a bexiga urinária e remova-a, cortando o mais próximo possível da cloaca. Descarte este lenço.</li>
	<li>Consultando a Figura 14B, identifique o intestino grosso e puxe-o para cortar o intestino grosso o mais próximo possível da cloaca. Remova e descarte todo o canal alimentar, cortando o peritônio onde ele se liga ao baço. Os corpos gordos agora estarão totalmente acessíveis.</li>
	<li>Separe os corpos gordurosos para que fiquem de lado. A área sobre o rim, onde o corpo gorduroso se conecta ao peritônio, será visível. Segure a base do corpo gorduroso esquerdo (à direita do espectador) e use uma tesoura para cortá-lo do peritônio, deixando uma pequena margem para que o rim não seja danificado (Figura 15).</li>
	<li>Remova e descarte o corpo gordo restante. Os rins emparelhados agora estarão totalmente visíveis.</li>
	<li>Em rãs fêmeas ou machos com ovidutos vestigiais distintos, segure um oviduto e puxe-o para longe do rim e da cloaca (Figura 16). Corte o oviduto onde ele encontra a cloaca e continue a puxá-lo para longe do rim, cortando quaisquer anexos peritoneais claros à medida que se tornam aparentes. Descarte este lenço.</li>
	<li>Repita este processo com o oviduto restante.</li>
	<li>Os rins ainda estão cobertos por peritônio claro (retroperitoneal)10. Use uma pinça para agarrar os rins e cortar o peritônio em sua extremidade inferior.</li>
	<li>Levante os rins para fora da cavidade celômica, usando uma tesoura para cortar o peritônio o mais próximo possível dos rins sem danificá-los (Figura 17).</li>
	<li>Sob ampliação de 5x, corte o excesso de peritônio e qualquer outro tecido remanescente (corpos de gordura, baço). Se o sapo for fêmea, certifique-se de que qualquer tecido ovariano restante seja removido (Figura 18). Se o sapo for macho, remova cuidadosamente o testículo e verifique se há um oviduto vestigial, que pode não ser visível sem ampliação (Figura 19).</li>
	<li>Remova os pinos do animal, vire-o em seu ventrum e prenda novamente os membros do animal.</li>
	<li>Selecione o membro posterior para amostrar e fixe o pé desse membro.</li>
	<li>Remova uma aba de pele em forma de amêndoa sobre o gastrocnêmio / tibiofíbula (Figura 20).</li>
</ol>

Protocolo Padronizado de Dissecção e Amostragem para Órgãos Xenopus Adultos

<ol>
	<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography.">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li><li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li><li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li><li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tadpole+tissue+harvest.">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).</li><li>L&#337;w, P., Moln&#225;r, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+Frog+(Rana+sp.).">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li><li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+used+in+research+and+teaching.">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li><li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus.">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287 (2023).</li><li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus.">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li><li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species.">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li><li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+(Xenopus+tropicalis).">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li><li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+(Silurana)+tropicalis+frogs.">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li><li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li><li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol.">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Como este protocolo visa maximizar o frescor, algumas amostras podem incluir tecidos indesejados. Por exemplo, o ducto hepatopancreático e algum mesentério são amostrados com o pâncreas, e algum tecido peritoneal, glândulas supra-renais e ureteres sempre serão amostrados com os rins pareados.  Se o frescor não for uma preocupação, uma amostragem mais precisa pode ser obtida usando técnicas modificadas.
A aparência e a localização dos órgãos são comparáveis entre os sexos e as...

Embora a "dissecação digital" de Xenopus adulto esteja disponível1, a amostragem replicável de órgãos e tecidos de Xenopus adulto permanece um desafio sem as instruções detalhadas disponíveis para outros modelos adultos (por exemplo, camundongos 2,3,4). Este artigo tem como objetivo fornecer orientações claras para amostragem precisa e replicável de órgãos de Xenopus adultos, semelhante ao que está atualmente disponível para suas larvas5. A ênfase é colocada na facilidade de conclusão para manter o máximo de frescor e tornar o protocolo acessível a todos os usuários.
Embora exista um guia de dissecação completo para Rana sp.6, bem como vários guias de dissecação em sala de aula para outros anuros7, nenhum guia de dissecação e amostragem de Xenopus está disponível atualmente. Para aqueles que não estão familiarizados com as práticas de amostragem ou anatomia dos anfíbios, as pequenas diferenças entre Xenopus e outros anuros tornam esses recursos abaixo do ideal para amostragem de tecido replicável.
Muitos tecidos valiosos não estão incluídos e são até descartados no presente guia; Isso é para garantir o frescor do tecido. Seis amostras são limitadas o suficiente para garantir que esses tecidos possam ser coletados em menos de uma hora após o coração começar a bater, independentemente da experiência ou nível de habilidade do usuário. Guias mais avançados e detalhados para coletar muitos outros tecidos estão sendo preparados como artigos complementares separados.
Para usuários menos experientes, é sempre recomendável que este protocolo seja tentado primeiro em animais que estão sendo sacrificados por outros motivos que não a experimentação antes de amostrar quaisquer animais que sejam difíceis de substituir (ou seja, transgênicos, animais de idade avançada, etc.). Idealmente, todos os animais amostrados serão saudáveis e, se fêmeas, não terão ovulado nas últimas duas semanas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>B08QJ6J8P1</td>
			<td>light must not produce heat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76457-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tray</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>14-370-284</td>
			<td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;2860</td>
			<td>alternative opaque containers acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthanasia container lid</td>
			<td>US Plastic&#160;</td>
			<td>Item&#160;3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iridectomy Scissors 6&#34;</td>
			<td>vwr</td>
			<td>470018-938</td>
			<td>iris scissors are an acceptable alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td>
			<td>Pentair AES</td>
			<td>TRS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-606-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Forceps, Serrated</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Pins for Dissecting</td>
			<td>Fisher Scinetific</td>
			<td>S99385</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus tem sido um poderoso organismo modelo para entender o desenvolvimento e a doença dos vertebrados por mais de cem anos. Embora as técnicas de análise experimental e dissecação do embrião tenham sido bem documentadas, as descrições das estruturas e órgãos adultos de Xenopus , juntamente com as técnicas para trabalhar com adultos, não foram atualizadas para levar em consideração os requisitos de abordagens modernas como proteômica quantitativa e transcriptômica de célula única. As perspectivas centradas no tipo celular e no gene requerem observações contrastantes em estágios embrionários com as dos tecidos adultos. Os órgãos da larva sofrem mudanças significativas em sua estrutura geral, morfologia e localização anatômica ao longo da transição larval para adulta, principalmente durante a remodelação maciça da metamorfose. O estabelecimento de padrões robustos para identificação e dissecção de órgãos é crucial para garantir que os conjuntos de dados resultantes de estudos realizados em diferentes laboratórios possam ser consistentes. O presente protocolo identifica seis dos órgãos do Xenopus adulto, demonstrando métodos para dissecção e amostragem do ventrículo cardíaco, fígado, corpo adiposo, pâncreas, rim pareado e pele do Xenopus adulto. Dependendo dos métodos de preservação, os órgãos dissecados podem ser usados para proteômica quantitativa, transcriptômica de célula única/núcleo, hibridização in situ , imuno-histoquímica, histologia, etc. Este protocolo visa padronizar a amostragem de tecidos e facilitar as investigações multilaboratoriais dos sistemas de órgãos adultos.

Utilizando a Figura 1 à Figura 20 e seguindo todas as etapas deste protocolo, o ventrículo cardíaco, o lobo esquerdo do fígado, o pâncreas, os corpos adiposos esquerdos, rins pareados e um retalho de pele foram excisados de forma limpa dentro de uma hora após a eutanásia. Dentro desse tempo, as amostras são enxaguadas e aparadas para que apareçam, conforme mostrado na Figura 21.
<p class="jove_content b=iglegend" fo:kee...

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Autor em destaque: Padronizando a amostragem de tecidos em pesquisa proteômica e imunoquímica

Este artigo apresenta um guia para amostragem de seis órgãos significativos e diversos em Xenopus adultos que podem ser acessados de forma rápida e fácil: o ventrículo cardíaco, o lobo do fígado, o pâncreas, os corpos adiposos, os rins pareados e a pele.

Técnicas para amostragem rápida de seis órgãos cruciais em Xenopus adultos

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

Antes deste trabalho, desenvolvi um protocolo para perfusão rápida de anfíbios. Este protocolo deve ser utilizado antes da amostragem para pesquisas como proteômica e imunoquímica, onde a presença de quantidades excessivas de sangue nos tecidos é indesejável. Embora existam muitos diagramas e outros auxílios disponíveis, atualmente não há guias abrangentes sobre como dissecar tecidos de xenopus adulto de forma rápida e confiável.Esperamos que as técnicas de amostragem padronizadas permitam que os laboratórios compartilhem tecidos facilmente. Isso é especialmente vantajoso em situações em que a importação e exportação de animais não é possível devido a preocupações de biossegurança ou restrições de transporte.

techniques-for-rapidly-sampling-six-crucial-organs-in-adult-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

788 visualizações.  Harvard Medical School. Antes deste trabalho, desenvolvi um protocolo para perfusão rápida de anfíbios. Este protocolo deve ser utilizado antes da amostragem para pesquisas como proteômica e imunoquímica, onde a presença de quantidades excessivas de sangue nos tecidos é indesejável. Embora existam muitos diagramas e outros auxílios disponíveis, atualmente não há guias abrangentes sobre como dissecar tecidos de xenopus adulto de forma rápida e confiável.Esperamos que as técnicas de amostragem pa...

Vídeo: Autor em destaque: Padronizando a amostragem de tecidos em pesquisa proteômica e imunoquímica

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Biologia

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish Adulto

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

O<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Cut-aberto vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Com Fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Reconstituição de β-catenina degradação na<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrato de ovo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Técnicas de coleta de sangue não terminal em cobaias

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Técnicas de fenotipagem mícron-escala de milho feixes vasculares, com base na tomografia computadorizada de Microcomputed de raio-x

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis beneath the injury site. To date, there is no functional recovery therapy for SCI, and there is a lack of clarity regarding the many complexes and dynamic events occurring after SCI. Many non-mammalian organisms can regenerate after severe SCI, such as teleost fishes, urodele amphibians, and larval stages of anuran amphibians, including Xenopus laevis tadpoles. These are bona fide model organisms to study and understand the response to SCI and the mechanisms underlying successful regenerative processes. This type of research can lead to the identification of potential targets for SCI therapeutic intervention. This article describes how to perform Xenopus laevis tadpole spinal cord transection, including husbandry, surgery, postsurgery care, and functional test evaluation. This injury method can be applied for elucidating the different steps of spinal cord regeneration by studying the cellular, molecular, and genetic mechanisms, as well as histological and functional evolution after SCI and during spinal cord regeneration.

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole spinal cord transection is a relevant injury method to study spinal cord injury and regeneration by making a transverse cut that completely severs the spinal cord at the thoracic level.

Transeção da Medula Espinhal em Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...