Nosso protocolo é otimizado para o modelo do mouse e utiliza materiais que estão prontamente disponíveis para todos os investigadores. Esta técnica pode ser aplicada a modelos de camundongos saudáveis, doenças ou geneticamente alterados. Nosso protocolo permitirá que os pesquisadores respondam a quaisquer perguntas sobre biologia pericíte cardíaca de qualquer modelo de doença ou variação genética.
Este procedimento fornecerá uma visão da biologia do pericíte cardíaco e nos ajudará a entender sua contribuição para a homeostase cardíaca e hemodinâmica na saúde e na doença. Coloque o rato anestesiado na posição supina e coloque seus membros dianteiros. Abra cuidadosamente a cavidade torácica, e cannulate a aorta descendente usando uma agulha borboleta de calibre 25.
Faça um corte no átrio direito. Em seguida, perfunde o coração com pelo menos 20 mililitros de 250 unidades por mililitro heparinizado, sem cálcio-magnésio-livre de fosfato salina tamponada em dois mililitros por minuto com uma bomba peristáltica de fluxo variável. A perfusão é completa quando o PBS limpo sai da ária direita.
Corte o coração na aorta, e coloque-o no DPBS sem cálcio e magnésio gelado. Então, transfira o coração para uma placa de Petri de 15 por 15 centímetros. Corte o coração em pequenos pedaços usando tesouras de mola e fórceps de ponto fino com solução de enzima suficiente para cobrir as peças.
Agora, transfira as peças e a solução para um tubo cônico de 50 mililitros, e selado com filme plástico parafina. Incubar a 37 graus Celsius em um agitador orbital a 120 rpm por 75 minutos. Após a digestão da colagem com a solução enzimática, decante o líquido através de um coador de células de 100 mícrons em um novo tubo de 50 mililitros, deixando solução suficiente para que as peças não sequem.
Usando fórceps de ponto fino, retire o tecido do tubo e coloque alguns pedaços em um slide de microscópio. Em seguida, triture o tecido entre dois slides de microscópio para quebrar o tecido. Enxágüe os slides com mídia cultural sem enzimas em um novo tubo cônico de 50 mililitros.
Repita esta etapa até que todas as peças de tecido sejam dissociadas. Misture a solução tensa e o tecido moído em um tubo. Coe a suspensão resultante através de um coador de células de 100 mícrons em um novo tubo cônico de 50 mililitros.
Centrifugar a amostra a 220 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Aspire fora da solução anterior, e resuspenque suavemente a pelota de célula em tampão de coloração FACS frio contendo DPBS e albumina de soro bovino. Conte as células e verifique a viabilidade usando um contador de células.
Diluir as células para um milhão de células por mililitro com tampão de coloração FACS frio contendo DPBS e albumina de soro bovino. As células estão prontas para serem manchadas e classificadas. Prepare e rotule tubos FACS de cinco mililitros para todos os controles e amostras de células.
Alíquota de um mililitro de células por tubo para uma amostra não manchada, fluorescência menos um controles, e controles combinados com isótipo. Use as células restantes para o tipo. Todos os controles e amostras podem ser preparados e manchados ao mesmo tempo.
Além disso, prepare e rotule tubos FACS de cinco mililitros para um total de nove controles de compensação, dois tipos de contas não manchadas mais sete fluorochromes diferentes do painel marcador. Para otimizar os controles de compensação da fluorescência, adicione uma gota de contas de compensação do frasco de espremer a cada tubo. Em seguida, adicione um microliter de anticorpos às contas.
Repita cada anticorpo do painel de marcadores. Use controles FMO para otimizar a coloração de fundo devido à sobreposição espectral. Às células dos tubos de controle FMO, adicione todos os anticorpos do painel marcador em uma diluição de um a 100, mas exclua um anticorpo.
Repita para cada anticorpo para um total de sete controles. Use anticorpos de controle compatível com isótipo para coloração inespecífica. Às células dos tubos rotulados com isótipo, adicione o anticorpo de controle compatível com isótipo em uma diluição de um a 100.
Em seguida, prepare as células para serem classificadas. Às células recém-isoladas, adicione um coquetel de anticorpos em uma diluição de 1 a 100. Além disso, adicione corante de viabilidade celular em uma diluição de 1 a 1.000.
Misture vigorosamente os controles de compensação por vórtice de pulso. Incubar por 30 minutos a quatro graus Celsius, protegido da luz, exceto pelas contas de viabilidade celular, que podem ser deixadas à temperatura ambiente, protegidas da luz. Misture suavemente os controles FMO, os controles combinados com isótipo e as células a serem classificadas por vórtice de pulso.
Incubar por 30 minutos a quatro graus Celsius, protegido da luz. Adicione três mililitros de tampão de coloração FACS a cada controle de compensação, controle FMO e controle isótipo. Centrifugar os tubos a 300 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Aspire a solução e resuspenja cada pelota em 400 microliters de tampão de coloração FACS. Os controles de compensação, os controles FMO e os controles isótipos estão agora prontos para serem usados. Após a coloração, lave as células com tampão de coloração FACS por centrifugação a 300 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Aspire a solução e resuspense a pelota celular no tampão de coloração FACS para 0,5 milhões de células por mililitro. Usando novos tubos FACS que possuem topos de filtro de 35 mícrons, pipete as amostras de células manchadas nas tampas e filtragem de gravidade para obter suspensões unicelulares. Mantenha-se no gelo.
Use um classificador de células para purificar as células. Execute as células não manchadas no classificador de células para definir tensões e corrigir para o sinal de fundo. Execute cada amostra de contas de compensação de uma cor única uma de cada vez para ajustar tensões para cada canal e ajustar portões para o sinal positivo.
Colete os dados. Use o software para calcular a sobreposição espectral calculando a matriz de compensação. Todas as tensões estão prontas e definidas.
Execute cada controle isótipo um de cada vez. Esses dados podem ser usados para ajustar portões para vinculação não específica, se houver algum. Execute cada amostra de FMO uma de cada vez.
Ajuste as tensões para cada canal para corrigir o sangramento espectral devido a um painel multicolor. Execute as amostras de células manchadas no classificador de células. Colete células em mídia de cultura sem enzimas de 10 mililitros em um tubo de coleta cônica de 15 mililitros.
Use a seguinte estratégia de gating. Primeiro, portão para células individuais. Então, portão para células vivas.
Em seguida, portão para células CD45 negativos. Portão para células CD34 e CD31 negativos. Em seguida, portão para células NG2 positivas.
E, finalmente, portão para células CD146 e CD140b positivo. Para a cultura dos pericitos, sementes as células recém-obtidas em meios culturais livres de enzimas em uma placa revestida de 24 poços. Cultura as células em uma incubadora celular fixada a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono e 95% oxigênio.
Após digestão enzimática e dissociação de todo o coração e antes da purificação das células, as células são uma mistura bruta que contém muitos tipos diferentes de células do coração. Após a purificação e cultivo do FACS, as células são homogêneas. Eles são nucleados únicos, bastante planos, e têm a típica morfologia pericíte rhomboid.
Usando FACS, as células são purificadas para a homogene. Primeiro, destroços e doublets foram fechados com base em distribuições de dispersão para a frente e para o lado. Em seguida, células mortas foram fechadas devido à sua reação de amina com o corante, que produz um sinal maior e mais intenso do que as células vivas.
Das células vivas, as células hematopoiéticas foram fechadas por serem CD45-positivas. Para remover ainda mais as células hematopoiéticas e endoteliais, células CD34-positivas e CD31-positivas foram fechadas. Finalmente, células NG2-positivas e CD140b/CD146-positive foram selecionadas por serem células perivasculares com expressão de marcadores pericílitos típicos.
Quando comparadas com pericílitos cerebrais humanos, as células tinham uma morfologia semelhante. Comparadas com as células musculares lisas do camundongo e humano, as células tinham uma caracterização fenotípica diferente das células na passagem sete pela imunocitoquímica para marcadores pericílitos não apresentaram alterações observadas na morfologia ou expressão de marcadores. Da mesma forma, a análise por citometria de fluxo dos pericítos na passagem sete confirmou que a população permaneceu homogênea.
A viabilidade celular é fundamental para obter um bom rendimento. Mantenha o tecido frio durante a aquisição, e mantenha as células frias durante a coloração celular. Além disso, certifique-se de que a solução enzimática seja preparada fresca a cada vez.
Para garantir o isolamento das células corretas pós-cultivo, caracterizá-las com citometria de fluxo e coloração imunofluorescente. Essas células podem ser utilizadas em experimentos de cocultura com células endoteliais para estudos de barreira funcional, bem como ensaios para estudar sua função e características biológicas e fisiológicas. Os pericítos cardíacos desempenham um papel fundamental na integridade e estabilidade vascular, e sua disfunção é consequente à função cardíaca global.
Com nossa técnica, os pesquisadores podem explorar o potencial terapêutico dos pericítos cardíacos.
