O protocolo descreve o isolamento do IMS pulmonar e a transferência adotiva após a determinação de IL-33 em modelo muro, o que pode facilitar o estudo in vivo da fibrose pulmonar idiopática. A técnica permite explorar a função dos macrófagos, simulada pelas citocinas tradicionais, no desenvolvimento da FPI. Para começar, retire o frasco de lipossomas clodronatos da geladeira.
Deixe aquecer por 30 minutos em temperatura ambiente e inverta várias vezes para garantir uma mistura uniforme. Aspirar 60 microlitros de lipossomas clodronados usando uma pipeta com uma ponta de sucção estéril. Administrar o controle e a droga gota a gota na cavidade nasal do camundongo anestesiado.
Após cada gota, certifique-se de que o rato inala a droga completamente e respira uniformemente. Após a depleção de macrófagos alveolares no camundongo receptor, comece desinfetando a pele do camundongo hospedeiro anestesiado com álcool e iodo a 75%. Use tesoura para cortar a pele e expor o tecido cardiopulmonar.
Aspirar 10 mililitros de PBS em uma seringa equipada com uma agulha de calibre 20 e inserir a ponta da agulha no átrio direito do mouse. Em seguida, corte a veia cava inferior do camundongo com tesoura cirúrgica e perfunda manualmente o camundongo com PBS a uma velocidade constante de 10 a 20 mililitros por minuto até que o tecido pulmonar fique branco. Além disso, excise o tecido pulmonar e transfira-o para PBS gelado em uma placa de cultura.
Cortar o tecido pulmonar em fragmentos e adicionar 15 mililitros de meio DMEM contendo 1% de colagenase A para isolar os macrófagos e, em seguida, incubá-lo a 100 RPM por 30 minutos em uma mesa de agitação de 37 graus Celsius. Aspirar a suspensão de tecido pulmonar aproximadamente 20 vezes através de uma seringa de 10 mililitros para torná-la fina. Filtre a suspensão através de um filtro de células de 40 micrômetros.
Centrifugar o filtrado a 400 G durante 10 minutos. Depois de descartar o sobrenadante, lise o sangue vermelho com três mililitros de tampão de lise celular no gelo por dois a três minutos. Centrifugar a 150 G por cinco minutos e ressuspender o pellet celular em 10 mililitros de DMEM.
Em seguida, conte as células usando um hemocitômetro. Seme as células em uma placa de cultura celular aderente de 10 centímetros e incube por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para aderir os macrófagos intersticiais pulmonares às placas. Após uma hora, aspirar o sobrenadante e as células flutuantes.
Adicione 10 mililitros do meio de cultura fresco e completo e incube por mais de oito horas ou durante a noite. Para estimular os macrófagos intersticiais isolados, substituir o meio de cultura irradiado por um meio completo de interleucinas 33. Prepare também uma placa de controle adicionando PBS em vez de interleucinas 33.
Incubar as placas por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para dissociar os macrófagos intersticiais pulmonares, tratá-los com um mililitro de tripsina a 0,25% por cinco minutos. Em seguida, adicione três mililitros de meio de cultura fresco completo para apagar a digestão e centrifugar a suspensão celular para colher os macrófagos pulmonares.
Após a contagem das células, ressuspenda as células em PBS para uma concentração final de cinco vezes 10 a quinta células por 50 microlitros. Para iniciar a transferência de macrófagos intersticiais, fixe os membros do camundongo receptor anestesiado em uma placa vertical com fita adesiva e puxe suavemente a língua do camundongo para um lado, usando um cotonete. Depois de ligar a lâmpada de intubação, brilhe-a na garganta do rato para ver a traqueia, que deve estar perto da base da língua.
Insira a cânula da agulha de demora na traqueia usando a lâmpada de intubação de calibre 22 e o fio-guia de 0,4 milímetro de diâmetro. Para terminar a intubação, remova o fio-guia e empurre a cânula para dentro da traqueia do rato. Agora injete 50 microlitros da suspensão celular no camundongo receptor através da traqueia quando a cânula for vista entrando na traqueia.
Após 24 horas, administrar bleomicina pela traqueia para induzir fibrose pulmonar idiopática. Administrar também um volume igual de soro fisiológico ao grupo controle. Após 21 dias, determinar o grau de gravidade da fibrose pulmonar avaliando a expressão dos marcadores de fibrose e os escores de Ashcroft.
A coloração HE mostrou que a transferência adotiva de interleucinas 33 estimulou macrófagos exacerbados o grau de destruição do tecido pulmonar e aumentou a agregação de fibroblastos nos camundongos estimulados por bleomicina, em comparação com o controle. O aumento do escore de Ashcroft também ilustra o grau de fibrose pulmonar. Os níveis de expressão de RNAm de alfa SMA e fibronectina nos tecidos pulmonares do camundongo receptor contendo macrófagos intersticiais estimulados por 33 interleucinas transferidas adotivamente e tratados com bleomicina foram mais altos, em comparação com os dos camundongos selvagens tratados com BLM.
500 microlitros de ar devem ser imediatamente inseridos nos pulmões com uma seringa de um milímetro para garantir que a suspensão celular na cânula possa entrar completamente no tecido pulmonar.
