Este protocolo descreve o sistema de dimerização química para induzir condensados proteicos em telômeros. Pode ser facilmente adaptado para induzir condensados em outros loci genômicos, e é adequado para sondar a formação e função de condensados associados à cromatina. Este método oferece resolução temporal necessária para imagens de células vivas e mantém a separação de fases na população de células para ensaios bioquímicos.
Para começar, dissolva os dimerizadores no DMSO a 10 mililitros e armazene-os em tubos de microcentrifusagem de plástico a menos 80 graus Celsius para armazenamento a longo prazo. Diluir uma alíquota de 10 mililitros em média de imagem para uma concentração de estoque de 10 micromolares e armazená-lo a menos 20 graus Celsius. Quando estiver pronto para usar, diluir os dimerizers para uma concentração final de trabalho de 100 nanomolar em meio de crescimento ou meio de imagem.
Semente 10 a quinta células em óculos de cobertura circular de 12 milímetros de diâmetro revestidos com Poli-D-Lysine em uma placa de seis poços. Em seguida, transfeme as células com os plasmídeos mutantes Halo-GFP-TRF1 e mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDFR-SIM e espere 24 a 48 horas antes de prosseguir para a imunofluorescência. Adicione os 100 dimerizers nanomolar diluídos às células e incuba-os em 37 graus Celsius por quatro a cinco horas.
Após a incubação, fixe as células em solução PBS contendo 4% de formaldeído e 0,1% Triton X-100 por 10 minutos à temperatura ambiente para permeabiliizar as células. Em seguida, lave as células três vezes com PBS. A tampa de lavagem desliza duas vezes com 50 microliters de TBS-Tx e uma vez com 50 microliters de tampão de diluição de anticorpos.
Incubar cada deslizamento de cobertura com 50 microliters de anti-PML primário, anti-SUMO-1, ou anticorpo anti-SUM-2 e 3 a quatro graus Celsius em uma câmara umidificada durante a noite. A tampa de lavagem desliza três vezes com tampão de diluição de anticorpos para remover o anticorpo primário não ligado e, em seguida, incubar as células com anticorpo secundário por uma hora em uma caixa escura à temperatura ambiente. Após a coloração, a tampa da lavagem desliza três vezes com TBS-Tx.
A etiqueta desliza adicionando dois microliters de um micrograma por MILilitro DAPI, em seguida, gire a tampa desliza e coloque-as na queda do DAPI. Aspirar fluido extra da borda do deslizamento de tampa. Sele o slide com esmalte, deixe secar e enxágue a parte superior da tampa com água.
Coloque os slides no congelador até a imagem. Semente 10 para a quinta células em óculos de cobertura circular de 12 milímetros revestidos com Poli-D-Lysine em uma placa de seis poços e transfectá-los com Halo-TRF1 e mCherry-eDHFR-SIM ou plasmids mutantes mCherry-eDHFR-SIM. Fixar as células com 4% de formaldeído por 10 minutos em temperatura ambiente e lavá-las quatro vezes com PBS.
Para IF-FISH, colorigue as células com anticorpos primários e secundários e refixe-as com 4% de formaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente, depois lave-as quatro vezes com PBS e desidrate as tampas em uma série de etanol. Incubar os deslizamentos de cobertura com a sonda 488 telomere C-PNA em cinco microliters de solução de hibridização a 75 graus Celsius por cinco minutos, em seguida, incubar os deslizamentos de cobertura durante a noite em uma câmara umidificada à temperatura ambiente. Lave os deslizamentos de tampa três vezes com tampão de lavagem por dois minutos por lavagem à temperatura ambiente e monte-os com um micrograma por MILilitro DAPI em meios de montagem para imagem.
Para imagens ao vivo, monte os deslizamentos de cobertura em câmaras magnéticas em um palco aquecido em uma câmara ambiental, mantendo as células em um mililitro de meio de imagem sem fenol vermelho. Configurar o microscópio e o aparelho de controle ambiental conforme descrito no manuscrito do texto. Localize células com um sinal GFP brilhante nos telômeros e sinal mCherry difusivo no citosol.
Encontre cerca de 20 células, memorizando cada posição com as informações do XYZ e configure parâmetros para imagens com lapso de tempo. Use espaçamento de 0,5 micrômetros para um total de oito micrômetros em Z e intervalo de tempo de cinco minutos durante duas a quatro horas para ambos os canais GFP e mCherry. Use 30% de 594 nanômetros e 50% de intensidade de potência de 488 nanômetros, com tempos de exposição de 200 milissegundos e um ganho de câmera de 300.
Inicie a imagem e faça um loop de tempo como pré-dimerização. Em seguida, pausar a imagem, adicionar 0,5 mililitros de mídia de imagem contendo 15 microliters de 10 dimerizer micromolar à câmara de imagem, tomando cuidado para não tocar no palco, e retomar a imagem. Quando estiver pronto para reverter a dimerização, pause a imagem e adicione 0,5 mililitros de mídia de imagem contendo dois microliters de 100 mililitros de estoque TMP à câmara de imagem.
Continue a imagem das células por uma a duas horas. Para imagens fixas, use a mesma configuração de microscópio que a imagem ao vivo, mas sem o aquecimento do palco. Localize em torno de 30 a 50 células com o sinal vermelho para selecionar para células transfeinadas.
Adquira imagens com espaçamento de 0,3 micrômetro para um total de oito micrômetros em Z.Use 80% de 647 nanômetros, 80% de 561 nanômetros e 70% de intensidade de potência de 488 nanômetros, com tempos de exposição de 600 milissegundos e um ganho de câmera de 300. A localização telômérica do SUM foi identificada utilizando-se de mieloma de DNA de telômero e imunofluorescência proteica sumô. Células com recrutamento de SIM enriqueceram o SUMO-1 e SUMO-2 e 3 em comparação com células com recrutamento mutante sim, indicando que a dimerização sim induzida enriquecimento de SUMO em telômeros depende de interações SUMO-SIM.
Um filme de lapso de tempo do TRF-1 e sim após a dimerização é mostrado aqui. O SIM foi recrutado com sucesso para telômeros, e tanto os focos sim quanto o TRF-1 tornaram-se maiores e mais brilhantes, como previsto para a formação e crescimento de gotículas líquidas. Além disso, observou-se fusão de focos do TRF-1, o que levou ao agrupamento de telômero, como mostra o número reduzido do telômero e aumento da intensidade do telômero ao longo do tempo.
Em contraste, o mutante SIM foi recrutado para telômeros após a dimerização, mas não induziu nenhuma formação de gotícula ou agrupamento de telômeros, indicando que a separação de fases e o agrupamento de telômeros são impulsionados por interações SUMO-SIM. A inversão da separação de fase e agrupamento de telômero foi observada após a adição de TMP livre de excesso. O número de telômero aumentou e a intensidade do telômero diminuiu com o tempo.
Imagens representativas de APBs identificadas por peixe de DNA de telômero e proteína PML IF são mostradas aqui. Células com SIM recrutados têm mais APBs do que células com mutantes SIM recrutados, sugerindo que condensados induzidos por dimerização são de fato APBs. Ao executar este protocolo, não exponha dimerizers sensíveis à luz.
Trabalhe em uma sala escura com uma lâmpada que emite luz vermelha e enrole células com papel alumínio durante a incubação. Após este procedimento, a rotulagem de proximidade pode ser usada para gerar uma lista abrangente de componentes no condensado induzido. Imagens vivas podem ser usadas para acompanhar a dinâmica dos componentes do condensado.
Esses métodos podem ajudar a determinar os papéis do controle da composição do condensado.
