Como elemento mineral importante, o cálcio desempenha um papel fundamental no crescimento e no controle de qualidade de frutas como a maçã, pode regular a dureza, o teor de açúcar, o período de armazenamento e a desordem fisiológica durante o armazenamento. A imagem de cálcio é o método mais ocidental para detectar alterações dinâmicas nos íons de cálcio no citoplasma. Indicadores fluorescentes de moléculas pequenas, como o fluo-4/AM, têm seletividade específica de íons de cálcio e podem ser carregados não invasivamente pela incubação de esterificação, que é flexível, rápida e não citotóxica.
Este protocolo introduzirá um método para carregar fluo-4/AM de reagente fluorescente químico de pequenas moléculas em protoplastos vegetais. Extração protoplasta Adicione 0,5 mililitro de solução enzimada em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Escolha uma maçã saudável e madura, em seguida, corte a polpa em 10 vezes 5 vezes 1 mililitro cúbico tamanho.
Coloque as peças de polpa em solução enzimática e feche o tubo. Incubar tubo a 28 graus por uma hora. Barrado a 70 rpm no escuro.
Depois disso, lave as peças de polpa, aspire toda a solução enzimática e adicione 0,5 mililitro de solução básica. Centrifugar a uma velocidade de 300 g por 2 minutos. A suspensão protoplasta pode ser obtida aspirando a solução inferior.
Coloração de reagente de fluorescência química de pequenas moléculas. Prepare a solução de carregamento fluo-4/AM com uma fluo-4/AM de 2 mililitros, 20% de etil127 e a solução salina tamponada com fosfato de 10X em uma proporção de um a um a dois. Adicione 1 solução de carregamento de microliter de suspensão de fluo-4/AM a 99 microliter protoplast suspensão.
A concentração final de corantes fluorescentes é de 5 micromolar. Misture a solução e feche o tubo. Ao mesmo tempo, o lantâneo passa o cálcio ou a singularidade do pequeno agente químico químico fluorescente.
Adicione um microliter ou 10 microliter mais ferro lantânido e, em seguida, uma solução de carregamento microliter de fluo-4/AM à suspensão de protoplastos de microliter. A concentração final de ferro lantâneo é de 100 micromolar. Misture a solução e feche o tubo.
Incubar a 37 graus por 30 minutos no escuro. Depois disso, centrífuga na velocidade de 300 G por dois minutos. Aspire a 17 microliters solução e adicione uma solução básica de 17 microliteres.
Incubar a suspensão do protoplasto a 37 graus por 30 minutos completamente Depois disso, aspire a suspensão de 50 microliter protoplastos e gotejamento em um slide. Observe sob microscópio de fluorescência. Selecione a ampliação de 20x e o canal GFP para observar.
Ajuste uniformemente o brilho para 0,5. Um passo crítico neste método proposto é lavar a mancha nos protoplastas e incuba-las por 30 minutos. A lavagem insuficiente causa excesso de apoio na fluorescência durante a observação e a incubação permite um melhor carregamento ou a sonda no citoplasma.
Protoplastos Viability Assay Tome 99 microliter protoplasts suspensa após incubar a 37 graus por 30 minutos. Adicione 1 ml na solução FD à suspensão de protoplastos. Misture a solução pipetting para cima e para baixo várias vezes e, em seguida, feche o tubo.
Fique em temperatura ambiente por cinco minutos no escuro. Prepare os slides e observe-os no microscópio de fluorescência com canal GFP. Apresentamos a vocês resultados Seguindo a figura um.
Utilizamos o método enzimático todos os protoplastos obtidos da polpa. Alguns protoplastos tinham um vacuole, enquanto outros não. Os protoplastos ficaram manchados com FD por cinco minutos e mostram o florescente no citoplasma indicando que a alta temperatura, 37 graus, não afeta a viabilidade ou protoplastos Figura dois.
Os protoplastos não apresentaram fluorescência em um dos ferros de cálcio indicador fluorescência ou não está carregado neles. Do que em fluo-4/AM foi carregado no protoplasto, o citoplasto, mas não um vacuole tornou-se fluorescente. Ferros de lanthanum que efetivamente bloqueiam os canais de cálcio são a membrana celular foram adicionados ao carregamento protoplasto fluo-4/AM.
Na concentração final de 100 ferros de lantano de lantâneo micromolar reduzem significativamente a intensidade de fluorescência de cálcio. Esses resultados demonstraram ainda que o fluo-4/AM efetivamente permanece nos ferros de cálcio no citoplasto e mostra mudanças dinâmicas no teor de ferros de cálcio. Figura três Os resultados do fluo-4/AM foram analisados utilizando-se a coloração de fluo-4/AM aprovada pelo IMH mais 6,0 de software fluo-4/AM com adição de ferros de lantanos reduziram significativamente o valor de floresnce dos ferros citoplasmados de cálcio.
Neste vídeo, todos os protoplastos foram obtidos por hidrólise enzimática. Nós carregamos com sucesso as sondas fluorescentes em um protoplasta a 37 graus. Além disso, o método não afetou a viabilidade dos protoplastos.
Em resumo, o método descrito aqui em espécie detalhado. As mudanças dinâmicas nos íons citoplasmicas de cálcio nas células de polpa da maçã, proporcionando assim 10 suportes iguais para a finalidade de estudos relacionados ao cálcio.
